Témoin de charge pour test Western blot

Témoins de charge

Le Western blot est une technique communément utilisée pour déterminer la concentration de protéines données dans un échantillon (par ex. homogénat ou extrait tissulaire). Les anticorps dirigés contre les témoins de charge sont des témoins importants car ils indiquent si les échantillons ont été chargés de manière égale dans les différents puits. Les témoins de charge indiquent également que les protéines ont été adéquatement transférées sur la membrane au cours du test Western blot.

Les témoins de charge sont typiquement des protéines omniprésentes exprimées à des niveaux élevés. Le niveau d'expression des témoins de charge doit rester le même quel que soit le type de tissu ou de cellule et quelles que soient les conditions expérimentales.

Le tableau ci-dessous énumère un certain nombre de témoins de charge permettant de normaliser la quantité de protéines dans un Western blot.

UTILITÉ NOM POIDS MOLÉCULAIRE (kDa)
Extraits cytoplasmiques / de cellules entières Actine ~ 42
Extraits cytoplasmiques / de cellules entières GAPDH ~ 37
Extraits cytoplasmiques / de cellules entières Tubuline 50 - 55
Extraits de mitochondries VDCA1 / Porin 31
Extraits nucléaires Histone H2B 14
Extraits nucléaires PCNA 36
Extraits nucléaires TBP 38

Des informations supplémentaires sur les témoins de charge pour Western blot sont fournies ci-dessous.



Actine

Utilité: Extraits cytoplasmiques / de cellules entières

Poids moléculaire: ~42 kDa

Les actines font partie des protéines les mieux conservées dans l'évolution. Les actines comportent trois principaux groupes isoformes : alpha, bêta, et gamma. On retrouve les actines alpha dans le tissu musculaire. Elles représentent une composante majeure de l'appareil contractile. Les actines bêta et gamma sont présentes dans la plupart des différents types de cellules en tant que constituantes du cytosquelette, et sont des médiateurs du trafic, de l'intégrité structurale et de la motilité cellulaire.

Remarque: Il a été observé que la modification des conditions de prolifération cellulaire et des interactions avec les composantes de la matrice extracellulaire modifie la synthèse de la protéine d'actine.

Anticorps dirigés contre l'actine bêta


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Glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH)

Utilité: Extraits cytoplasmiques / de cellules entières

Poids moléculaire: ~37 kDa

La glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) sert à dégrader le glucose pour obtenir de l'énergie et des molécules de carbone en catalysant la sixième étape de la glycolyse. Elle est aussi impliquée dans la transcription, la liaison à l'ARN et son transport, la réplication et la réparation de l'ADN ainsi que l'apoptose et le transit des vésicules entre le RE et le Golgi. La GAPDH est constamment exprimée à un niveau élevé dans la plupart des tissus et types de cellules mais son expression peut varier d'un tissu à l'autre.

Remarque: L'hypoxie, le diabète et certains types de cancer peuvent augmenter l'expression de la GAPDH dans certains types de cellules.

Anticorps dirigés contre la GADPH


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Histone H2B

Utilité: Extraits nucléaires

Poids moléculaire: 14 kDa

L'histone H2B est l'une des cinq histones de base (H1, H2A, H2B, H3 et H4) impliquées dans la structure de la chromatine des cellules d'eucaryotes. L'histone H2B possède un domaine globulaire principal et une longue queue N terminale qui fait partie de la structure "en collier de perles" du nucléosome. Les histones sont présentes en abondance dans pratiquement toutes les cellules d'eucaryotes.

Remarque: La quantité d'histones double avant la division cellulaire si bien que celles-ci ne sont pas appropriées pour comparer les cellules de la phase S et de la phase pré-S.

Anticorps dirigés contre l'histone H2B


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Antigène nucléaire de prolifération cellulaire (PCNA - Proliferating Cell Nuclear Antigen)

Utilité: Extraits nucléaires

Poids moléculaire: 36 kDa

L'antigène nucléaire de prolifération cellulaire (PCNA) est une protéine hautement conservée au cours de l'évolution. Le PCNA est un cofacteur de la DNA polymérase ? dans les cellules d'eucaryotes et permet d'augmenter la processivité de la synthèse du brin direct durant la réplication de l'ADN. Le PCNA est un exemple de pince à ADN car il encercle l'ADN (créant ainsi une liaison topologique avec le génome).

Remarque: Le PCNA est rapidement dégradé quand les voies de réparation de l'ADN sont activées.

Anticorps dirigés contre le PCNA


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Protéine de liaison avec la boîte TATA (TBP - TATA Binding Protein)

Utilité: Extraits nucléaires

Poids moléculaire: 38 kDa

La protéine de liaison avec la boîte TATA (TBP) est largement exprimée mais son niveau d'expression est maximal dans les testicules et les ovaires. La TBP est un facteur de transcription qui se lie spécifiquement à la boîte TATA. La boîte TATA est une séquence d'ADN qui se trouve dans la région du promoteur des gènes d'archées et d'eucaryotes. La TBP est une composante du TFIID, un facteur de transcription multiprotéique qui se lie à l'ADN. Ce facteur forme à son tour partie du complexe de pré-initiation (PIC) de l'ARN polymérase II.

Remarque: La TBP n'est pas un témoin de charge approprié lorsque l'ADN et d'autres composantes nucléaires ont été éliminés.

Anticorps dirigés contre la TBP


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Tubuline

Utilité:Extraits cytoplasmiques / de cellules entières

Poids moléculaire: 50 - 55 kDa

Les tubulines sont exprimées de manière stable à des niveaux élevés et sont bien conservées entre espèces. Les tubulines sont les composantes principales des microtubules. Les microtubules sont composées de dimères de tubulines alpha et bêta. Les microtubules sont impliqués dans le maintien de la forme de la cellule ainsi que dans plusieurs processus cellulaires tels que le positionnement des organelles cellulaires, le transport intracellulaire et le transport extracellulaire par les flagelles et les cils. Elles jouent également un rôle dans la division cellulaire (mitose et méiose) y compris dans la formation des fuseaux mitotiques.

Remarque: L'expression de la tubuline peut varier en fonction de la résistance aux médicaments antimicrobiens et antimitotiques.

Anticorps dirigés contre la tubuline


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Le canal ionique VDCA1 (Voltage-Dependent Anion-Selective Channel Protein 1) / Porine

Utilité: Extraits de mitochondries

Poids moléculaire: 31 kDa

Le canal ionique VDAC1, également appelé 31HM, porine 31HL ou porine plasmalème, est exprimé de manière universelle dans tous les tissus et conservé d'une espèce à l'autre. On le retrouve dans la membrane extérieure des bactéries à Gram négatif, les mitochondries ainsi que les chloroplastes. Le VDCA1/la porine sont des protéines à feuillets bêta formant une structure cylindrique traversant une membrane cellulaire et agissant comme un pore à travers lequel des molécules peuvent diffuser.

Anticorps dirigés contre le VDCA1/la porine


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