Antibody Validation: Knockout and Knockdown Validated Antibodies

Des performances fiables des anticorps sont essentielles à la reproductibilité de la recherche en sciences de la vie. Un anticorps peut générer un signal intense tout en détectant des protéines non ciblées ou en produisant un bruit de fond dépendant de l'application. La validation des anticorps vise donc à fournir des preuves expérimentales indiquant que le signal observé est associé à la cible recherchée dans des conditions expérimentales définies.

Plusieurs stratégies complémentaires peuvent être utilisées pour évaluer la spécificité d'un anticorps. Parmi les approches les plus directes figurent les méthodes de validation génétique, dans lesquelles l'expression de la cible est supprimée ou réduite, puis le signal de l'anticorps est comparé à celui d'un contrôle approprié. La validation par knockout (KO) et knockdown (KD) peut ainsi fournir des preuves solides que la détection par l'anticorps dépend de la présence de la protéine cible.

La validation d'un anticorps doit toujours être interprétée dans le contexte de l'application testée, du type d'échantillon et des conditions expérimentales. Une validation dans un système expérimental ne garantit pas automatiquement les performances dans toutes les autres applications. Découvrez ci-dessous les différentes approches de validation, notre validation réalisée en interne et notre gamme d'anticorps validés par KO et KD.

Découvrir les anticorps validés par KO et KD

Validation génétique des anticorps

La validation génétique évalue la spécificité d'un anticorps en modifiant expérimentalement l'expression du gène codant pour la protéine cible. Des échantillons dans lesquels l'expression de la cible a été supprimée ou réduite sont comparés à des échantillons exprimant normalement la cible. Si le signal de l'anticorps évolue de manière correspondante, cela soutient la conclusion selon laquelle le signal détecté provient de la cible recherchée.

Deux stratégies courantes sont le knockout (KO), dans lequel le gène cible est inactivé, et le knockdown (KD), dans lequel l'expression de la cible est réduite. Bien que les deux approches reposent sur le même principe général, le résultat expérimental attendu et son interprétation diffèrent.

Validation par knockout (KO)

La validation par knockout compare la détection de l'anticorps dans un échantillon exprimant la cible à celle obtenue dans un échantillon génétiquement comparable dans lequel le gène cible a été inactivé. L'édition génomique CRISPR/Cas est fréquemment utilisée pour générer des lignées cellulaires knockout, mais des animaux knockout et d'autres modèles présentant une déficience génétique peuvent également constituer des contrôles appropriés.

Dans une expérience idéale de validation KO, l'échantillon de type sauvage ou parental produit un signal spécifique de la cible, tandis que ce signal est absent dans l'échantillon knockout. Cette comparaison fournit un contrôle négatif défini génétiquement et peut constituer une preuve solide que le signal observé dépend de l'expression de la cible.

Dans le cadre d'une validation par Western blot, par exemple, une bande correspondant au poids moléculaire attendu doit être détectable dans l'échantillon de type sauvage et disparaître dans le lysat knockout correspondant. Le même principe peut être appliqué à d'autres méthodes basées sur les anticorps lorsque des contrôles KO appropriés sont disponibles.

La validation KO nécessite néanmoins une interprétation appropriée. L'édition génomique peut générer des produits protéiques alternatifs ou tronqués, et les cellules knockout peuvent développer des adaptations biologiques compensatoires. Le système expérimental doit donc confirmer que la protéine cible pertinente ou l'épitope reconnu par l'anticorps est effectivement absent.

Voir les anticorps validés par KO

Exemple d'anticorps validé par KO : Synaptopodin

L'anticorps anti-Synaptopodin ABIN1742348 constitue un exemple d'anticorps validé par KO dans notre gamme. Synaptopodin est une protéine associée à l'actine exprimée dans les podocytes différenciés ainsi que dans certains compartiments neuronaux. Les contrôles knockout permettent une évaluation particulièrement rigoureuse de la détection dépendante de la cible.

Dans l'expérience de validation, le signal obtenu avec l'anticorps anti-Synaptopodin est comparé entre des homogénats de cerveau de souris de type sauvage et des homogénats provenant de souris knockout pour Synaptopodin. La disparition du signal spécifique dans l'échantillon knockout étaye une détection spécifique de la cible.

Plus d'informations

Détection de Synaptopodin dans des homogénats de cerveau de souris de type sauvage (WT) et knockout (KO) pour Synaptopodin.

Validation par knockdown (KD)

La validation par knockdown repose sur un principe similaire, mais réduit l'expression de la cible au lieu de la supprimer complètement. L'extinction génique peut être obtenue à l'aide d'approches telles que les siRNA ou shRNA, tandis que d'autres systèmes comme l'interférence CRISPR peuvent également être utilisés pour réprimer l'expression génique.

Le signal de l'anticorps est comparé entre des cellules témoins et des cellules dans lesquelles l'expression de la cible a été réduite. Une diminution correspondante du signal de l'anticorps soutient la conclusion selon laquelle le signal détecté est associé à la protéine recherchée.

Contrairement à la validation par knockout, un signal résiduel est généralement attendu, car le knockdown supprime rarement toute l'expression de la cible. L'ampleur de la diminution du signal doit donc être interprétée en tenant compte de l'efficacité de la déplétion de la cible.

La validation KD peut être particulièrement utile lorsqu'un knockout complet est difficile à réaliser sur le plan biologique ou lorsque la perte de la cible affecte fortement la viabilité ou le phénotype cellulaire. Toutefois, une extinction incomplète ainsi que les effets hors cible de la procédure de knockdown peuvent rendre l'interprétation plus complexe que dans un modèle knockout bien caractérisé.

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Exemple d'anticorps validé par KD : SNAP47

L'anticorps anti-SNAP47 ABIN1742240 constitue un exemple d'anticorps validé par KD dans notre gamme. SNAP47 est une protéine associée aux synaptosomes impliquée dans le trafic vésiculaire. La validation par knockdown permet de montrer que la détection par l'anticorps suit la diminution de l'expression de la cible.

Dans les données de validation, des échantillons témoins sont comparés à des échantillons traités avec un siRNA ciblant SNAP47. La diminution des signaux d'immunofluorescence et de Western blot après knockdown, associée à l'analyse quantitative, étaye une détection spécifique de SNAP47. Les analyses par immunofluorescence et Western blot montrent une réduction du signal SNAP47 après knockdown induit par siRNA. La quantification confirme une diminution significative des niveaux de SNAP47 (P < 0,005). La βIII-tubuline est utilisée comme contrôle de charge.

Plus d'informations

Validation par knockdown de SNAP47 dans des échantillons témoins et des échantillons traités avec un siRNA ciblant SNAP47.

Validation knockout vs knockdown

Les validations KO et KD reposent sur la même stratégie fondamentale : modifier l'expression de la cible et déterminer si le signal de l'anticorps suit cette modification. La principale différence réside dans le fait que l'expression de la cible est soit supprimée, soit réduite.

Interprétation des données de validation

Les expériences KO et KD fournissent des preuves solides de la spécificité d'un anticorps lorsque les modifications du signal correspondent aux changements génétiquement contrôlés de l'expression de la cible. La validation d'un anticorps ne constitue toutefois pas une propriété absolue d'un réactif. Les performances peuvent dépendre de l'application, de la préparation des échantillons, de l'espèce, du tissu ou du type cellulaire, de la concentration de l'anticorps et des conditions expérimentales.

La validation génétique doit donc être considérée comme une preuve étayant les performances de l'anticorps dans le contexte expérimental testé. Lorsque cela est possible, le niveau de confiance peut être renforcé en combinant la validation génétique à d'autres approches, telles que l'utilisation d'anticorps indépendants, de données d'expression orthogonales ou d'autres contrôles positifs et négatifs appropriés.