FACS Antibodies

Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est un type spécialisé de cytométrie de flux. Il permet de trier un mélange hétérogène de cellules biologiques dans deux conteneurs ou plus, une cellule à la fois, sur la base des caractéristiques spécifiques de diffusion de la lumière et de fluorescence de chaque cellule et des anticorps qui y sont fixés.

Utilisez le champ de recherche pour parcourir notre portefeuille d'anticorps FACS ou consultez notre Guide de la cytométrie en flux.

Guide de la cytométrie en flux (FACS Analysis)

Développée à l'origine à la fin des années 1960, la cytométrie en flux est une technique populaire de biologie cellulaire analytique qui utilise la lumière pour compter et profiler les cellules dans un mélange fluide hétérogène. La cytométrie en flux est une méthode particulièrement puissante car elle permet au chercheur de collecter rapidement, précisément et simplement des données relatives à de nombreux paramètres à partir d'un mélange fluide hétérogène contenant des cellules vivantes.

La cytométrie en flux est largement utilisée dans l'ensemble des sciences de la vie et des sciences biomédicales, et peut être appliquée dans tout scénario où un chercheur a besoin de profiler rapidement une grande population de cellules en vrac dans un milieu liquide. Par exemple, en immunologie, la cytométrie en flux est utilisée pour identifier, séparer et caractériser divers sous-types de cellules immunitaires en vertu de leur taille et de leur morphologie.

Lorsque des informations supplémentaires sont nécessaires, des anticorps marqués par des colorants fluorescents et levés contre des antigènes de surface cellulaire hautement spécifiques (par exemple, des grappes de différenciation ou des marqueurs CD) peuvent être utilisés pour mieux identifier et séparer des sous-populations spécifiques au sein d'un groupe plus large.

Dans un cytomètre à flux :

• Les cellules de l'échantillon passent une par une dans un canal étroit.
• La lumière est utilisée pour éclairer les cellules dans le canal.
• Une série de capteurs détectent les types de lumière qui sont réfractés ou émis par les cellules.
• Les données acquises par les capteurs sont compilées et intégrées pour construire une image complète de l'échantillon.

Les différents types de lumière utilisés dans une expérience de cytométrie en flux

Un cytomètre en flux utilise la lumière réfractée ou émise pour compter et identifier les cellules. Découvrez les différents types de lumière utilisés dans une expérience de cytométrie en flux dans les figures suivantes.

Forward Scatter

La lumière diffusée vers l'avant est réfractée par une cellule dans le canal d'écoulement et se poursuit dans le trajet de la lumière (c'est-à-dire dans la même direction que celle dans laquelle la lumière se déplaçait initialement). La lumière diffusée vers l'avant est détectée par un capteur dans le trajet de la lumière, et est généralement utilisée pour identifier la taille des particules.

La lumière diffusée vers l'avant est le plus souvent utilisée pour détecter la taille de l'objet dans le chemin lumineux. Les objets plus grands produiront plus de lumière diffusée vers l'avant que les objets plus petits, et les cellules plus grandes auront un signal de diffusion vers l'avant

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Side Scatter

La lumière diffusée latéralement la lumière passe de la source d'éclairage dans le canal d'écoulement, est réfractée par les cellules dans une direction qui est en dehors du chemin lumineux original. La lumière diffusée latéralement est détectée par un capteur qui est orthogonal au chemin lumineux d'origine.

La lumière diffusée latéralement est généralement utilisée pour faire une détermination concernant la granularité et la complexité de la cellule dans le trajet lumineux. Les cellules très granuleuses avec une grande quantité de complexité interne, comme les neutrophiles, produiront plus de lumière diffusée latéralement, et un signal de diffusion latérale plus élevé que les cellules à faible granularité et complexité.

Fluorescence Emission

La lumière fluorescente est émise par des molécules fluorescentes après excitation par un laser de longueur d'onde compatible. La lumière fluorescente peut provenir de matériaux naturellement fluorescents dans la cellule, ou peut provenir de colorants fluorescents ou d'anticorps marqués par fluorescence qui ont été utilisés pour marquer une structure spécifique sur la cellule.

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Multiparametric Analysis

Un dot-plot de cytométrie en flux simulé, traçant les diffusions avant vs latérales d'une population de leucocytes. Les populations de cellules sont marquées par leur identité probable :

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D Débris présumés, très petits éléments avec une faible diffusion avant et latérale.

L/MLeucocytes/monocytes probables, cellules petites à moyennes avec une complexité interne/granularité faible. Ces cellules génèrent une intensité de signal moyenne en diffusion avant et faible en diffusion latérale

G Granulocytes probables, grandes cellules à complexité interne/granularité élevée. Ces cellules génèrent des signaux de diffusion avant et latérale élevés.

Bien que certaines identités puissent être confirmées par les profils de diffusion avant et latérale, le marquage avec un marqueur spécifique du type de cellule offre toujours une plus grande résolution et une plus grande certitude lors du profilage de populations hétérogènes complexes de cellules.

Les profils de diffusion avant et latérale permettent de confirmer certaines identités.

Par exemple, dans le tracé ci-dessus, un chercheur peut être en mesure de distinguer les granulocytes et les lymphocytes en utilisant la lumière diffusée vers l'avant et la lumière latérale. Cependant, trois classes de granulocytes (neutrophiles, basophiles et éosinophiles) sont très similaires en taille et en structure, ce qui leur confère des propriétés de diffusion de la lumière similaires. Dans ce cas, les neutrophiles pourraient être marqués de manière sélective en vertu de leur expression d'un marqueur spécifique des neutrophiles comme ELANE.

FACS : Tri des cellules sur la base des données de la cytométrie en flux

Les termes cytométrie en flux et tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) sont souvent utilisés de manière interchangeable. En pratique, il existe des différences entre ces deux méthodes. Le FACS est un dérivé de la cytométrie en flux qui ajoute un degré exceptionnel de fonctionnalité. Grâce à la FACS, un chercheur peut trier physiquement un mélange hétérogène de cellules en différentes populations. En utilisant des anticorps hautement spécifiques marqués par des colorants fluorescents, un chercheur peut effectuer une analyse FACS et recueillir simultanément des données sur un échantillon et le trier en fonction d'un nombre presque illimité de paramètres différents.

Dans une expérience FACS :

• Les données de diffusion vers l'avant, de diffusion latérale et de fluorescence sont collectées, comme dans la cytométrie de flux conventionnelle.
• Les paramètres définis par l'utilisateur fournissent des informations sur la façon dont les cellules doivent être triées.
• Sur la base de ces paramètres, la machine FACS utilise une électrode pour imposer une charge électrique à chaque cellule.
• En sortant de la chambre d'écoulement, des électro-aimants vont trier les cellules par charge dans des récipients séparés.

À quoi ressemblent les données de cytométrie en flux ?

Dans une expérience de cytométrie en flux, chaque cellule qui passe dans le cytomètre en flux et qui est détectée sera classée comme un événement distinct. En outre, chaque type de lumière détecté par le cytomètre en flux (diffusion vers l'avant, diffusion latérale et chaque longueur d'onde d'émission de fluorescence) se verra attribuer son propre canal unique. Les données de cytométrie en flux traceront chaque événement indépendamment, et représenteront l'intensité du signal de la lumière détectée dans chaque canal pour chaque événement.

Les données de cytométrie en flux sont généralement représentées de l'une des deux manières suivantes : les histogrammes, qui ne mesurent ou ne comparent qu'un seul paramètre, et les dot-plots qui comparent 2 ou 3 paramètres simultanément sur un nuage de points à deux ou trois dimensions.

Un histogramme trace généralement l'intensité détectée dans un seul canal le long d'un axe et le nombre d'événements détectés à cette intensité se trouve sur un axe distinct. Un grand nombre d'événements détectés à une intensité particulière sera affiché comme un pic sur l'histogramme. En revanche, dans un diagramme à points, chaque événement est représenté par un seul point sur un nuage de points. Les intensités de 2 canaux différents (ou 3 canaux différents dans un diagramme tridimensionnel) sont représentées le long des différents axes. Les événements ayant des intensités similaires se regrouperont dans la même région sur le nuage de points.

Note:Dans les données du nuage de points, les grands échantillons entraîneront souvent un lourd regroupement d'événements représentés dans la même région du tracé. Il existe de nombreuses méthodes pour ajouter une résolution supplémentaire à ces régions. Par exemple, une carte thermique, comme dans l'exemple ci-dessus, peut être utilisée pour fournir des informations sur la densité d'événements dans une région donnée du tracé.

Les histogrammes et les histogrammes sont des outils qui permettent d'améliorer la résolution des données.

Les histogrammes et les dot-plots offrent tous deux différents avantages pour l'analyse des données de cytométrie en flux. Choisir la meilleure façon de représenter vos données peut vous aider à vous assurer qu'elles racontent une histoire complète dans un format simple et compréhensible.

Les graphes et les histogrammes ne s'excluent pas mutuellement, et la plupart des expériences complexes de cytométrie en flux feront appel à plusieurs graphes pour afficher des données riches et multiparamétriques sur un échantillon. Dans de nombreux cas, plus de trois paramètres doivent être tracés simultanément. Dans ce cas, une technique d'analyse de données connue sous le nom de gating peut aider à donner une résolution et une flexibilité supplémentaires, permettant l'analyse d'une quantité presque illimitée de paramètres simultanément à travers plusieurs diagrammes de dispersion et histogrammes différents.

Le calibrage ajoute de la résolution aux données de cytométrie en flux

En bref, le gating est une méthode permettant de sélectionner les cellules d'une expérience de cytométrie en flux que vous souhaitez analyser de manière plus spécifique. Le gating permet à un chercheur de rassembler et d'afficher plus d'informations sur une sous-population de cellules que ce qui pourrait normalement être affiché sur un graphique en points à 2 ou 3 dimensions.

Le gate ajoute de la résolution à une expérience de cytométrie en flux, et permet l'analyse simultanée d'un nombre presque illimité de paramètres différents (canaux).

Dans une expérience de cytométrie de flux :

• Un utilisateur recueille les données de cytométrie en flux d'un ou plusieurs canaux sur un graphique en points.
• Sur la base des données acquises, l'utilisateur dessine une boîte de porte sélectionnant une sous-population de cellules pour une analyse plus approfondie.
• La sous-population de cellules à l'intérieur de la porte sera spécifiquement mise en évidence sur d'autres tracés affichant des informations provenant d'autres canaux.

Les portes ajoutent une incroyable quantité de flexibilité à la cytométrie en flux, en accordant jusqu'à une résolution unicellulaire pour chaque canal disponible pour le chercheur. Plusieurs portes peuvent être établies pour un seul nuage de points, et les portes peuvent être "empilées" et combinées (c'est-à-dire qu'une sous-population de cellules gated pour les canaux 1 et 2 peut être gated encore pour les canaux 3 et 4 afin de permettre une plus grande spécificité et une analyse plus approfondie).

Un exemple de déclenchement

Une note sur la compensation

Le débordement d'un canal dans un autre peut provoquer des signaux identifiés faussement comme positifs. Le débordement est le signal artéfactuel qu'un colorant fluorescent peut provoquer dans le canal d'un autre fluorophore en fonction de sa luminosité relative et de son spectre d'émission. C'est là que la compensation entre en jeu. La compensation est une procédure qui isole le signal d'un canal particulier des autres canaux utilisés dans la même expérience. Le FITC, par exemple, a son pic d'émission dans la gamme verte du spectre électromagnétique. Toutefois, il est également fluorescent dans le canal jaune où le PE émet de la lumière. En termes simples, la compensation soustrait le signal FITC du canal PE.

Ce signal dans le "mauvais" canal est soustrait du signal provoqué par le fluorophore d'intérêt. Dans l'échantillon ci-dessus, le rapport entre la composante verte et la composante jaune à une longueur d'onde d'excitation donnée est constant pour le FITC. Il est donc possible de déduire la quantité de signal jaune non spécifique du FITC dans le canal PE à partir de la mesure dans le canal vert en utilisant les coefficients de compensation constants. Il en va de même pour le débordement du PE dans le canal FITC.