L’épigénétique étudie les caractéristiques cellulaires et physiologiques héréditaires déterminées par des facteurs autres que des modifications de la séquence d’ADN. Il peut notamment s’agir de modifications chimiques simples, telles que la méthylation et l’acétylation de l’ADN ainsi que des protéines qui interagissent avec celui-ci. Ces modifications sont réversibles et n’altèrent pas directement la séquence nucléotidique. Elles jouent toutefois un rôle important dans la régulation de l’expression des gènes, en déterminant comment, où et quand certains gènes sont exprimés.
Ces modifications épigénétiques peuvent persister au cours des divisions cellulaires pendant toute la durée de vie d’une cellule et peuvent également être maintenues sur plusieurs générations, bien qu’elles n’impliquent aucune modification de la séquence d’ADN sous-jacente de l’organisme. La recherche en épigénétique peut contribuer à expliquer les mécanismes du vieillissement, du développement humain et l’origine de différentes pathologies telles que le cancer, les maladies cardiovasculaires et les troubles psychiatriques.
Cartographie des interactions protéine-ADN par ChIP
L’immunoprécipitation des complexes protéine-ADN (ChIP) permet d’étudier les mécanismes épigénétiques. Cette technique permet d’identifier les sites de liaison des protéines associées à l’ADN et d’étudier plus précisément les facteurs de transcription. Un clivage ciblé par une nucléase et la libération des fragments sont suivis d’une immunoprécipitation de la chromatine. Comme dans une immunoprécipitation conventionnelle (IP), la ChIP utilise des anticorps capables de reconnaître, de lier et d’isoler sélectivement des protéines, notamment les histones, les histones modifiées, les facteurs de transcription et leurs cofacteurs. Les séquences génomiques associées peuvent ensuite être identifiées par séquençage d’ADN à haut débit, une approche appelée ChIP-Seq.
Variantes de la ChIP
Plusieurs variantes de la ChIP sont couramment utilisées. Dans la X-ChIP, le formaldéhyde permet de réticuler la protéine d’intérêt à l’ADN. La fragmentation de la chromatine est ensuite réalisée par sonication ou digestion enzymatique à l’aide d’une nucléase.
Pour la ChIP native, la chromatine est isolée à partir de noyaux cellulaires préalablement traités par une nucléase. La chromatine est ensuite fragmentée par digestion avec une nucléase micrococcale, qui coupe préférentiellement l’ADN au niveau des régions de liaison entre les nucléosomes.
ChIP native
Avantages :
- Possibilité d’évaluer la spécificité de l’anticorps
- Meilleure spécificité de l’anticorps grâce à la conservation de la structure native des protéines
- Meilleure récupération de la chromatine et des protéines
Inconvénients :
- Ne convient pas aux protéines non histones
- Les nucléosomes peuvent se réorganiser au cours de la digestion
ChIP avec réticulation
Avantages :
- Convient à l’étude des facteurs de transcription
- Applicable à différents organismes
Inconvénients :
- Récupération moins efficace de la chromatine
- Peut entraîner des résultats faussement positifs
- La fragmentation aléatoire par sonication entraîne une forte variabilité de la longueur des fragments de chromatine
CUT&RUN – Une alternative supérieure au ChIP-Seq
Le séquençage CUT&RUN, également appelé Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease, est une méthode utilisée pour analyser les interactions entre les protéines et l’ADN. Le séquençage CUT&RUN associe un clivage contrôlé par une nucléase micrococcale ciblée par des anticorps à un séquençage massif parallèle de l’ADN afin d’identifier les sites de liaison des protéines associées à l’ADN.
Avantages du CUT&RUN
- Aucune réticulation nécessaire : l’ADN lié au facteur d’intérêt et clivé de part et d’autre du complexe est efficacement libéré en solution
- La digestion limitée de la chromatine à proximité immédiate des sites cibles réduit la production de fragments indésirables
- Meilleur rapport signal/bruit
- Réduction importante de la profondeur de séquençage nécessaire
- Applicable lorsque la quantité d’échantillon disponible est limitée
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