Protein Labels
Rédigé/ Édité par Julian Pampel, BScLes protéines non conjuguées ont démontré leur intérêt en tant que biomédicaments, mais elles présentent néanmoins certaines limites. Afin d'améliorer les niveaux d'expression, la solubilité, le repliement, la purification et la détection des protéines recombinantes, la conjugaison avec des peptides ou des protéines constitue une stratégie couramment utilisée. La plupart des techniques d'analyse des protéines et des cellules faisant appel à des anticorps utilisent des conjugués afin d'améliorer ou de simplifier la procédure. antibodies-online propose des anticorps conjugués à une grande variété de marqueurs colorimétriques et fluorescents pour des applications de détection, de purification, de tri et de microscopie.
À quoi servent les conjugués ?
Les conjugués sont des outils polyvalents remplissant plusieurs fonctions. Associés à une protéine ou à un peptide, ils peuvent être utilisés pour la séparation, mais aussi pour la détection de la protéine étudiée ou pour distinguer l'expression native d'une expression augmentée. Les conjugués d'anticorps servent principalement à détecter l'anticorps et ses partenaires de liaison, mais peuvent également être utilisés pour la séparation. Dans les expériences d'immunisation, les conjugués, notamment le KLH, sont largement employés comme protéines porteuses pour la production d'anticorps. Les haptènes de faible poids moléculaire, tels que les peptides, les petites protéines et les molécules médicamenteuses, sont généralement non immunogènes et nécessitent l'aide d'une protéine porteuse afin de déclencher une réponse immunitaire.
Séparation
Pour séparer des protéines, différents conjugués présentant une forte spécificité pour une matrice donnée peuvent être utilisés. Ces conjugués sont souvent de courtes séquences de 10 à 15 acides aminés, appelées tags. Comme ces tags possèdent des séquences connues et des propriétés physicochimiques bien caractérisées, ils constituent des outils essentiels en biologie moléculaire pour la purification des protéines recombinantes. Les tags épitopiques sont généralement introduits à l'extrémité N- ou C-terminale afin de limiter les perturbations de la structure tertiaire susceptibles d'altérer la fonction de la protéine. Parmi les exemples bien connus figurent le tag GST, le tag His et l'interaction entre la biotine et la streptavidine.
Détection
Outre la séparation, la détection et la localisation d'un antigène constituent une autre fonction importante des tags. Le choix du conjugué dépend de l'application expérimentale et permet une détection colorimétrique, fluorescente ou chimioluminescente des anticorps primaires en imagerie cellulaire, immunohistochimie, cytométrie en flux et Western blot. Le marquage fluorescent est une technique largement utilisée qui permet une lecture visuelle. Les conjugués non fluorescents peuvent être répartis en composés chimiques et composés biologiquement actifs. Les composés biologiquement actifs sont souvent utilisés pour la détection colorimétrique d'un antigène, par exemple en Western blot. Lorsque l'immunomarquage vise à fournir des informations sur des cellules isolées ou leurs sous-structures, on parle d'immunocytrochimie ; l'immunohistochimie désigne généralement les expériences dans lesquelles des cibles présentes dans de fines coupes de tissu sont colorées.
Composés chimiques
| Conjugué | Application |
| Gold | Microscopie électronique |
| Sepharose™ | Séparation par immunoprécipitation (IP) |
Composés biologiquement actifs
| Conjugué | Application |
| APC | FACS, microscopie électronique |
| HRP | WB, ELISA, IHC |
| Glucose Oxidase | Dosages enzymatiques |
Conjugués fluorescents
Un tag fluorescent permet de marquer et de détecter une biomolécule à un emplacement donné dans une cellule, un tissu ou un organe. Le marquage fluorescent, souvent appelé immunomarquage, utilise généralement un dérivé réactif d'une molécule fluorescente appelée fluorophore, appartenant à une classe de molécules capables d'absorber et d'émettre de la lumière. Les méthodes permettant de marquer une cible par fluorescence comprennent les colorants fluorescents, l'immunomarquage et les protéines de fusion fluorescentes. La GFP et ses variants font partie des tags fluorescents les plus couramment utilisés.
Un colorant donné est excité à une longueur d'onde spécifique et émet un photon à une longueur d'onde plus élevée. L'utilisation de la fluorescence augmente le contraste et améliore ainsi la lecture. La détection par fluorescence repose sur la différence entre les maxima d'absorption et d'émission propres à chaque fluorophore, appelée déplacement de Stokes. Un déplacement de Stokes important traduit un chevauchement réduit entre ces deux longueurs d'onde et est particulièrement souhaitable, car il permet de distinguer clairement la lumière émise de la source lumineuse utilisée pour l'excitation. Le marquage de différentes cibles avec des couleurs fluorescentes distinctes permet de visualiser plusieurs structures ou protéines dans une même cellule au cours de la même expérience. La gamme de tags fluorescents ne cesse de s'élargir. De nouvelles alternatives offrent des coefficients d'extinction, des rendements quantiques ou une photostabilité plus élevés, ce qui permet d'obtenir des signaux plus intenses et d'améliorer les possibilités de multiplexage.
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Anticorps, kits et protéines conjugués à des fluorophores
| Fluorophore | Pic d'excitation (nm) | Pic d'émission (nm) | Couleur d'émission |
| DyLight 405 | 400 | 421 |  |
| Alexa Fluor 405 | 401 | 421 | |
| DyLight 350 | 352 | 435 | |
| Alexa Fluor 350 | 346 | 442 | ATTO 390 | 390 | 470 |
| Alexa Fluor 488 | 493 | 519 | |
| FITC | 492 | 520 | |
| ATTO 488 | 501 | 523 | |
| Cy3 | 550 | 570 | |
| Alexa Fluor 594 | 550 | 570 | |
| Phycoerythrin (PE) | 565 | 578 | |
| ATTO565 | 563 | 592 | |
| ATTO 594 | 591 | 616 | |
| ATTO 633 | 629 | 657 | |
| APC | 650 | 661 | |
| Alexa Fluor 647 | 651 | 667 | |
| Cy5 | 650 | 670 | |
| PerCp | 490 | 675 | |
| ATTO 655 | 633 | 684 | |
| Cy5.5 | 675 | 694 | |
| ATTO 680 | 684 | 702 | |
| Alexa Fluor 700 | 702 | 723 | |
| Cy7 | 778 | 754 | |
| DyLight 800 | 771 | 796 | |
| Alexa Fluor 790 | 784 | 814 |
Colorants tandem
Les colorants tandem présentent un avantage supplémentaire, car ils permettent d'évaluer simultanément un plus grand nombre de marqueurs, notamment dans les expériences utilisant des panels multicolores. Un colorant tandem est constitué de deux fluorophores différents liés de manière covalente : une molécule donneuse et une molécule acceptrice. Lorsqu'elles sont suffisamment proches, l'énergie est transférée du donneur excité vers la molécule acceptrice. Ce transfert s'effectue par transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET), un mécanisme décrivant le transfert d'énergie entre deux molécules photosensibles.
Le colorant tandem est excité à la longueur d'onde d'excitation de la molécule donneuse et émet un photon à la longueur d'onde d'émission de la molécule acceptrice.
Grâce aux colorants tandem, un seul laser peut exciter plusieurs fluorophores dont les signaux sont mesurés par différents détecteurs. Cette approche augmente considérablement les possibilités de la cytométrie en flux multicolore et permet d'utiliser des panels de 12 couleurs ou davantage.
Conseils pour les colorants tandem
- Éviter l'exposition à la lumière afin de limiter le photoblanchiment
- Ne pas congeler afin de minimiser la dénaturation
- Tenir compte de l'excitation croisée entre faisceaux
- Ne pas fixer pendant plus de 30 minutes
- Tenir compte d'une forte variabilité entre les lots
- Des spectres d'émission étroits limitent le chevauchement spectral
De plus, le déplacement de Stokes d'un colorant tandem est supérieur à celui de la molécule donneuse d'origine, ce qui permet de mieux distinguer la source d'excitation de l'émission. Pour les expériences de colocalisation de deux protéines différentes, il convient donc d'éviter autant que possible le chevauchement des spectres d'émission. Lors d'expériences d'immunofluorescence multicolore, l'utilisation de fluorophores présentant des spectres d'émission étroits permet également de réduire le chevauchement spectral. antibodies-online propose des kits de dosage TR-FRET de haute qualité ainsi que des anticorps et des arrays rigoureusement testés pour vos expériences multiplex.
Tags épitopiques & protéines de fusion
Les tags protéiques sont des séquences peptidiques ajoutées génétiquement à une protéine recombinante. Ils peuvent être spécifiques de l'extrémité C-terminale, de l'extrémité N-terminale ou des deux extrémités. Les tags sont associés aux protéines pour différents objectifs et peuvent servir de tags d'affinité, de solubilisation, d'épitope ou de fluorescence. Plusieurs tags sont souvent combinés afin de relier une protéine à plusieurs autres composants. Les tags peuvent être retirés par des agents chimiques ou par des procédés enzymatiques tels que la protéolyse ou l'épissage d'intéines. Vous trouverez ci-dessous une liste détaillée de tags couramment utilisés avec les protéines recombinantes ainsi que leurs principales fonctions.
| Nom | Séquence | Utilisation(s) typique(s) * | Commentaires |
| AP Tag | 444 AA | D, Purif | Détection colorimétrique ; utile pour le Western blot, le far-Western blot, le Southern blot, l'ELISA sandwich et la localisation subcellulaire dans les systèmes d'expression bactériens et mammaliens ; permet une purification pratique d'extraits périplasmiques bruts de bactéries ; la purification d'anticorps ne fournit pas des rendements élevés ; une élution à faible pH peut modifier irréversiblement les propriétés de la protéine ; la matrice présente une réutilisabilité limitée ; la dimérisation et la grande taille de l'AP peuvent modifier les propriétés de la protéine de fusion. |
| AU1 Tag | DTYRYITDFYLK | D, Purif | Utilisé pour la visualisation par des méthodes immunochimiques. La séquence AU1 reconnue correspond à la séquence d'acides aminés DTYRYI, dérivée de la protéine majeure de capside du papillomavirus bovin de type 1 (BPV-1). L'épitope AU5 reconnu correspond à la séquence d'acides aminés TDFYLK. |
| AU5 Tag | DTYRYITDFYLK | D, Purif | |
| AviTag | GLNDIFEAQKIEWHE | Func, SDS, ELISA, WB | La technologie brevetée AviTag™ utilise une conjugaison enzymatique hautement ciblée d'une molécule unique de biotine sur un tag peptidique spécifique de 15 acides aminés in vitro ou in vivo, en utilisant la biotine ligase BirA de E. coli. Les protéines de fusion AviTag peuvent être purifiées à l'aide d'avidine monomérique. Les protéines de fusion AviTag peuvent être visualisées avec des conjugués d'avidine ou de streptavidine en Western blot, ainsi qu'avec des tétramères de CMH pour le marquage et le tri des cellules T. |
| Biotin Ligase Tag | GLNDIFEAQKIEWH | Détection et purification | Le tag Biotin Ligase est décrit comme la séquence peptidique minimale servant de substrat à la biotine holoenzyme synthétase BirA d'E. coli. En présence de BirA active, le tag Biotin Ligase, également appelé peptide accepteur de biotine, est biotinylé, ce qui permet sa détection ou sa purification avec la streptavidine. |
| CBP Tag | MKRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL | WB, FACS, IHC, IP, IF | Le tag d'affinité Calmodulin Binding Protein (CBP) est un outil utile pour l'étude des protéines et peut être ajouté à l'extrémité N- ou C-terminale d'une protéine d'intérêt grâce aux technologies de recombinaison de l'ADN. Ce tag est dérivé de la kinase de la chaîne légère de la myosine musculaire. Il comprend 26 résidus d'acides aminés et possède une masse moléculaire d'environ 4 kDa. Le tag CBP présente une affinité relativement élevée pour la calmoduline (CaM). Les protéines portant un tag CBP peuvent être purifiées à partir d'extraits cellulaires bruts à l'aide d'une résine d'affinité CaM. |
| CaM Tag | KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL | WB, FACS, IHC, IP, IF | |
| FLAG® Tag | DYKDDDDK | Func, PI, WB, IP, AbP | Le système d'expression FLAG® est une méthode éprouvée pour exprimer, purifier et détecter des protéines de fusion recombinantes. Il utilise un court peptide hydrophile de 8 acides aminés susceptible d'être présenté à la surface de la protéine. Cette bonne accessibilité facilite la liaison des anticorps ainsi que le clivage par l'entérokinase (Ek). La petite taille du tag peptidique FLAG® ne masque pas les autres épitopes ou domaines et n'altère généralement ni la fonction, ni la sécrétion, ni le transport de la protéine de fusion. La sensibilité peut être augmentée à l'aide de l'épitope 3x FLAG®. |
| glu-glu Tag | EYMPME | WB, ELISA, ICC/IF, IP, Purif | Le tag épitopique glu-glu est généralement introduit à l'extrémité N- ou C-terminale d'une protéine d'intérêt afin que la protéine marquée puisse être analysée et visualisée par des méthodes immunochimiques. L'épitope glu-glu reconnu correspond aux résidus d'acides aminés 314 à 319, EYMPME, de l'antigène middle T du polyomavirus murin. |
| GST Tag | Protéine de fusion, 220 AA | AP | La GST (glutathion S-transférase) se lie au glutathion immobilisé. Le tag GST est généralement ajouté à l'extrémité N- ou C-terminale d'une protéine d'intérêt afin de créer des protéines de fusion pouvant être purifiées par un pull-down assay, puis visualisées et analysées grâce aux propriétés du tag GST. |
| HA Tag | YPYDVPDYA | SDS, IHC, WB, ELISA | Le tag épitopique HA, dérivé de l'hémagglutinine du virus de la grippe humaine, repose sur une glycoprotéine de surface nécessaire à l'infectivité du virus. Le tag HA est dérivé de la molécule HA et correspond aux acides aminés 98 à 106. Il ne semble pas interférer avec la bioactivité ou la biodistribution de la protéine recombinante et facilite sa détection, son isolement et sa purification. L'épitope HA reconnu correspond à la séquence d'acides aminés YPYDVPDYA. |
| HAT Tag | KDHLIHNVHKEFHAHAHNK | Purif | L'épitope HAT (histidine affinity tag) est une séquence naturelle de résidus d'histidine non adjacents présentant une charge globale plus faible que les tags constitués de résidus His consécutifs. |
| His Tag | HHHHHH | SDS, WB, Crys, Func | Les tags polyhistidine sont utiles pour la détection et l'analyse des protéines recombinantes exprimées par immunoblotting, immunoprécipitation et techniques d'immunomarquage. |
| Myc Tag | EQKLISEEDL | FACS, IAC, IA, IHC, WB | La protéine c-Myc est un facteur de transcription codé par le gène c-Myc situé sur le chromosome humain 8q24. c-Myc est fréquemment activé dans différents types de cellules tumorales et joue un rôle important dans la prolifération et la différenciation cellulaires, l'apoptose et la progression du cycle cellulaire. Un peptide synthétique correspondant aux résidus 410 à 419 de la protéine humaine p62 c-Myc et conjugué au KLH est utilisé comme immunogène. Le tag c-Myc permet de localiser des produits géniques dans différents types cellulaires, d'étudier la topologie des protéines et des complexes protéiques et d'identifier des protéines associées. Il est déconseillé de fusionner le tag directement après le peptide signal d'une protéine sécrétée, car cela peut perturber la translocation vers la voie de sécrétion. |
| Rho Tag | MNGTEGPNFYVPFNSNKTGVV | Func, WB, IP, AbP | Le Rho-tag est un tag épitopique constitué d'un peptide de vingt résidus, MNGTEGPNFYVPFSNKTGVV, dérivé des 20 premiers acides aminés de la rhodopsine bovine. Il peut être utilisé pour augmenter les niveaux d'expression de certaines protéines membranaires eucaryotes ou pour permettre leur purification hautement spécifique. |
| SNAP-Tag® | Protéine de fusion (20 kDa) | Les systèmes de marquage protéique SNAP- et CLIP-tag® permettent la fixation spécifique et covalente de pratiquement n'importe quelle molécule à une protéine d'intérêt. Leur utilisation comporte deux étapes : le clonage et l'expression de la protéine d'intérêt sous forme de fusion SNAP-tag®, puis le marquage de cette fusion avec le substrat SNAP-tag® choisi. SNAP-tag® est une petite protéine basée sur l'O6-alkylguanine-DNA-alkyltransférase humaine (hAGT), une protéine de réparation de l'ADN. Les substrats SNAP-tag® sont des colorants, des fluorophores, de la biotine ou des billes conjugués à des groupes partants guanine ou chloropyrimidine par l'intermédiaire d'un linker benzyle. Au cours de la réaction de marquage, le groupe benzyle substitué du substrat est lié de manière covalente au SNAP-tag®. CLIP-tag™ est une version modifiée de SNAP-tag®, conçue pour réagir avec des dérivés de benzylcytosine plutôt qu'avec des dérivés de benzylguanine. Utilisé conjointement avec SNAP-tag®, CLIP-tag™ permet le marquage orthogonal et complémentaire de deux protéines simultanément dans les mêmes cellules. | |
| CLIP-Tag™ | Protéine de fusion | ||
| Strep Tag II® | SA-WSHPQFEK | WB, IF, IP | Le système Strep-tag® permet la purification et la détection des protéines par chromatographie d'affinité. Strep-tag® est un peptide synthétique composé de huit acides aminés (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys). Cette séquence peptidique présente une affinité intrinsèque pour Strep-Tactin®, une streptavidine spécialement modifiée, et peut être fusionnée à l'extrémité N- ou C-terminale de protéines recombinantes. Grâce à cette interaction hautement spécifique, les protéines portant un Strep-tag peuvent être isolées en une seule étape à partir de lysats cellulaires bruts. Strep-tag® pouvant être élué dans des conditions physiologiques douces, il est particulièrement adapté à la production de protéines fonctionnelles. |
| Twin-Strep Tag® | SA- WSHPQFEK (GGGS)2GGSA WSHPQFEK | WB | Un tandem Strep-tag®, anciennement appelé One-STrEP-tag®, destiné à la purification douce et rapide de complexes protéiques intacts sur Strep-Tactin® immobilisé. |
| T7 Tag | MASMTGGQQMG | WB, SDS, IP, MS | Le tag épitopique T7 est généralement introduit à l'extrémité N- ou C-terminale d'une protéine d'intérêt afin que la protéine marquée puisse être analysée et visualisée par des méthodes immunochimiques. L'épitope T7 reconnu correspond à la séquence d'acides aminés MASMTGGQQMG dérivée de la protéine majeure de capside du gène T7. |
| Trx Tag | Protéine de fusion | SDS, WB, MS, Func | Le tag Thioredoxin (TRX) est principalement utilisé pour augmenter la solubilité et la stabilité thermique des protéines exprimées dans les systèmes bactériens, où il facilite également le repliement de protéines nécessitant un environnement réducteur. Il constitue par ailleurs un tag épitopique utile et possède une masse moléculaire d'environ 12 kDa. |
| V5 Tag | GKPIPNPLLGLDST ou IPNPLLGLD | WB, IF, IP | Petit épitope (Pk) présent sur les protéines P et V du paramyxovirus Simian Virus 5 (SV5). Le tag épitopique V5 est généralement introduit à l'extrémité N- ou C-terminale d'une protéine d'intérêt afin que la protéine marquée puisse être analysée et visualisée par des méthodes immunochimiques. L'épitope V5 reconnu correspond aux résidus d'acides aminés 95 à 108, GKPIPNPLLGLDST, de la sous-unité alpha de l'ARN polymérase du Simian Virus 5. |
Abréviations : purification par affinité (AP), production d'anticorps (AbP), cytométrie en flux (FACS), études fonctionnelles (Func), cristallisation (Chrys), détection (D), immunocytrochimie (ICC), immunofluorescence (IF), immunohistochimie (IHC), immunoprécipitation (IP), immunoessai (IA), spectrométrie de masse (MS), interaction protéique (PI), Proximity Ligation Assay (PLA), purification (Purif), séparation (Sep), SDS-PAGE (SDS), Western blot (WB)
Creative mind of antibodies-online with a keen eye for details. Proficient in the field of life-science with a passion for plant biotechnology and clinical study design. Responsible for illustrated and written content at antibodies-online as well as supervision of the antibodies-online scholarship program.
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