Système pour l’expression de protéines

La production de protéines fonctionnelles constitue une étape essentielle pour étudier la fonction et la structure des protéines d’intérêt. Les enzymes recombinantes sont également utilisées dans les industries alimentaire et chimique, tandis que des protéines de haute qualité sont nécessaires pour des applications diagnostiques, thérapeutiques et pharmaceutiques. La synthèse chimique n’est pas suffisamment avancée pour reproduire correctement des structures protéiques complexes. Des organismes vivants sont donc modifiés afin de produire des protéines à partir d’informations génétiques fournies sous forme d’ADN. La structure de l’ADN permet de concevoir des matrices contenant les fonctions codées souhaitées, telles que des séquences supplémentaires de rapporteur ou de tag d’affinité. Les protéines produites à partir de matrices artificielles sont appelées protéines recombinantes. Cet article présente les avantages et les inconvénients des systèmes d’expression de protéines recombinantes microbiens, à base de cellules de mammifères et des systèmes végétaux acellulaires.

Expression de protéines recombinantes

Le premier protocole établi pour l’expression de protéines recombinantes repose sur la transfection de cellules hôtes avec un vecteur d’ADN contenant la matrice souhaitée, suivie de leur prolifération. La machinerie de transcription et de traduction des cellules hôtes produit de nombreuses copies de la protéine d’intérêt, qui peuvent ensuite être récupérées après lyse cellulaire et purification.

Depuis, de nombreux systèmes d’expression et protocoles ont été développés. Les systèmes d’expression protéique procaryotes comme eucaryotes in vivo sont largement utilisés. Le type de protéine, les exigences liées à son activité fonctionnelle et le rendement souhaité influencent le choix du système. Bactéries, levures, cellules d’insectes, de mammifères ou végétales : chaque système présente ses propres avantages et difficultés. Le choix du système adapté à l’application concernée est donc essentiel pour réussir l’expression d’une protéine recombinante. Le tableau suivant présente un aperçu des avantages et des défis associés aux différents systèmes d’expression.

Comparaison des systèmes d’expression protéique

Modifications post-traductionnelles

Après la traduction, les protéines subissent différentes modifications lors de la dernière étape de leur maturation afin de compléter leur structure, de déterminer leur localisation ou de réguler leur activité dans la cellule. Les modifications post-traductionnelles (PTM) correspondent à différents ajouts ou changements de la structure chimique et constituent des éléments essentiels de la biologie cellulaire. Elles peuvent notamment inclure l’élimination de segments par des peptidases, l’ajout de groupes phosphate, sucre ou lipide à certains acides aminés ainsi que la glycosylation. Les PTM peuvent se produire sur les chaînes latérales des acides aminés ou aux extrémités C- ou N-terminales de la protéine.

Après la synthèse de la protéine, des ponts disulfure se forment et la protéine adopte sa structure tridimensionnelle. La plus simple de ces modifications est l’élimination du résidu méthionine N-terminal, qui peut se produire chez tous les organismes. L’excision de la méthionine est régulée à plusieurs niveaux et joue un rôle important dans le contrôle du renouvellement protéique, c’est-à-dire l’équilibre entre synthèse et dégradation des protéines.

Les peptides signaux sont des séquences de 20 à 100 acides aminés, le plus souvent situées à l’extrémité N-terminale d’une protéine. Les propriétés de leurs acides aminés déterminent en grande partie leur interaction avec le système de transport des protéines et donc la destination vers laquelle la protéine est dirigée. Les protéines dépourvues de séquence signal appropriée restent dans le cytoplasme. Plusieurs séquences signal peuvent être combinées afin de permettre un double ciblage d’une protéine vers deux compartiments. Les séquences signal et les processus de transport diffèrent selon les règnes biologiques, ce qui représente un défi pour l’expression recombinante de protéines fonctionnelles.

Glycosylation

De manière similaire, des modifications plus complexes telles que les glycosylations N- et O-liées ainsi que la phosphorylation sont réalisées exclusivement par les cellules eucaryotes. Avec la nitrosylation, la liaison au GTP et l’acétylation des histones, elles contribuent à réguler la fonction et l’expression des protéines. La prénylation favorise la localisation membranaire des protéines.

La nature des glycanes N-liés fixés à une glycoprotéine dépend à la fois de la protéine et de la cellule dans laquelle elle est exprimée. Les hôtes d’expression eucaryotes, tels que les levures et les cellules animales, présentent des profils de glycosylation différents. La glycosylation des levures contient généralement une forte proportion de mannose, tandis que celle des cellules d’insectes est relativement simple et dépourvue d’acide sialique. Les cellules animales et humaines présentent des profils plus proches, mais avec une variabilité importante. Ces profils sont plus complexes et peuvent notamment comprendre du galactose, de l’acide sialique et du fucose. Ils varient également selon les espèces, qui synthétisent différents types de glycanes N-liés.

Les profils de glycosylation interviennent dans la migration cellulaire et jouent un rôle important dans la structure et la fonction des protéines. Ils peuvent favoriser le repliement protéique et améliorer la stabilité. Les immunoglobulines telles que les IgE, IgM ou IgG utilisent la glycosylation ; des modifications de l’affinité pour les récepteurs Fc et d’autres récepteurs immunitaires peuvent générer des fonctions effectrices spécifiques. Ceci est particulièrement important sur le marché en développement des anticorps monoclonaux thérapeutiques recombinants tels que

Infliximab

et

Rituximab

. Ces différences subtiles sont cruciales, car elles peuvent provoquer des réactions immunogènes potentielles. Les cellules d’ovaire de hamster chinois (CHO) se sont imposées comme une lignée cellulaire de référence dans la recherche biologique et médicale ainsi que dans la production commerciale de protéines thérapeutiques. Leurs profils de glycosylation sont très proches de ceux des cellules humaines. Néanmoins, les glycanes produits dans ces systèmes peuvent différer des glycanes humains, car ils peuvent être terminés à la fois par de l’acide N-glycolylneuraminique (Neu5Gc) et de l’acide N-acétylneuraminique (Neu5Ac), alors que les cellules humaines ne produisent que des glycoprotéines contenant de l’acide N-acétylneuraminique. De plus, les épitopes galactose-alpha-1,3-galactose présents sur des glycoprotéines produites dans des cellules animales peuvent provoquer de graves réactions anaphylactiques. Les chercheurs cherchent donc à optimiser ces systèmes par knockout génétique ou surexpression afin d’éliminer les voies responsables de la production de ces structures glycanes.

Consultez le tableau 2 pour identifier le système d’expression capable de réaliser les PTM dont vous avez besoin.

Expression protéique bactérienne

Les systèmes bactériens d’expression protéique sont largement utilisés pour la production de protéines recombinantes, en particulier à grande échelle. Des conditions de culture simples ainsi que la croissance rapide et facile des bactéries permettent une forte évolutivité à faible coût de production.

Ce système offre une qualité suffisante pour de nombreuses applications telles que la production d’anticorps, les essais fonctionnels et les études d’interactions protéiques. Cependant, les protéines eucaryotes exprimées dans des bactéries sont souvent non fonctionnelles, car les cellules bactériennes ne disposent pas de la machinerie nécessaire pour effectuer les PTM ou les étapes de repliement requises. Les problèmes de qualité liés à l’expression protéique bactérienne apparaissent généralement avec les protéines de grande taille (> 50 kDa), les structures protéiques complexes comprenant plusieurs domaines ainsi que les segments transmembranaires qui nécessitent plusieurs peptides signaux et des PTM telles que des ponts disulfure ou des glycosylations.

Un autre obstacle est l’agrégation des protéines recombinantes contenant des ponts disulfure dans E. coli sous forme de corps d’inclusion. E. colimaintient son cytoplasme dans un état réducteur qui défavorise fortement la formation de ponts disulfure stables dans les protéines.

Cette agrégation est une conséquence directe de l’absence de formation de ponts disulfure. 70 à 80 % des protéines recombinantes exprimées dans E. coli se retrouvent dans des corps d’inclusion. Leur purification est longue et nécessite généralement deux grandes étapes : l’extraction des corps d’inclusion à partir des bactéries, suivie de la solubilisation des corps d’inclusion purifiés.

Expression protéique dans les cellules d’insectes

Pour produire de grandes quantités d’une protéine recombinante fonctionnelle, de nombreux chercheurs se tournent vers les systèmes d’expression baculovirus. Comparée aux systèmes bactériens, l’expression protéique dans les cellules d’insectes se rapproche davantage des processus observés chez les mammifères. Ces systèmes sont donc particulièrement adaptés aux protéines difficiles à exprimer dans les bactéries en raison de leur taille, de leur complexité ou de leurs besoins en modifications post-traductionnelles. Ils peuvent être facilement mis à l’échelle et adaptés à des cultures en suspension à haute densité pour une production à grande échelle.

Parmi les systèmes d’expression eucaryotes, la plateforme utilisant des cellules d’insectes infectées par des baculovirus a suscité un intérêt particulier, conduisant au développement de nombreuses stratégies d’expression protéique. Elle exploite la capacité des baculovirus à insérer des gènes dans leurs cellules cibles et à induire l’expression de la protéine correspondante. L’espèce de baculovirus la plus couramment utilisée pour les études d’expression protéique est

Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV)

.

De nombreuses cellules d’insectes provenant notamment de drosophiles, de moustiques et de vers à soie ont été développées sous forme de lignées cellulaires. Au fil du temps, le tissu de la fausse-arpenteuse du chou (Trichoplusia ni) s’est imposé comme une lignée de choix, notamment grâce à sa croissance rapide et à sa moindre dépendance à l’hémolymphe d’insecte dans le milieu. La lignée Trichoplusia ni High Five (officiellement appelée BTI-Tn-5B1-4) exprime de manière constante 5 à 10 fois plus de protéines recombinantes que d’autres lignées de lépidoptères telles que les cellules Sf9. Elle peut être cultivée sans sérum, ce qui réduit considérablement les coûts de production, et peut croître sous forme faiblement adhérente ou en suspension.

Deux approches ont été développées pour l’expression dans les cellules d’insectes : l’expression sécrétée et extracellulaire. Le choix du ciblage d’une protéine dépend de sa localisation cellulaire à l’état natif. Les protéines qui fonctionnent dans le milieu extracellulaire sont exprimées sous forme de protéines sécrétées et récupérées dans le milieu. Pour une expression sécrétée, un peptide signal doit être introduit génétiquement dans la construction avec un tag (His), un site de reconnaissance de la protéase TEV et le gène souhaité. À l’inverse, les protéines qui fonctionnent dans le noyau ou dans le cytoplasme sont exprimées en intracellulaire.

Les principaux inconvénients de la production de protéines recombinantes dans les systèmes d’expression d’insectes sont les délais de production relativement longs et les coûts élevés. Comparez les avantages et les inconvénients des systèmes d’expression protéique en un coup d’œilou découvrez notre large gamme de protéines recombinantes de haute qualité exprimées dans des cellules d’insectes et disponibles chez antibodies-online.

Expression protéique dans les cellules de mammifères

Bien que de nombreuses protéines de mammifères aient été produites avec succès dans des bactéries, des levures ou des cellules d’insectes, la demande de cultures de cellules de mammifères augmente. Des protéines présentant une quantité et une qualité adaptées sont essentielles pour de nombreuses applications. Les systèmes d’expression utilisant des cellules de mammifères peuvent assurer un repliement correct des protéines, des modifications post-traductionnelles appropriées ainsi qu’un assemblage adéquat du produit, autant d’éléments importants pour une activité fonctionnelle complète. Ces avantages s’accompagnent cependant de conditions de culture plus exigeantes et de coûts de production élevés.

L’expression de protéines dans les cellules de mammifères peut être obtenue par transfection transitoire de plasmides, établissement de lignées cellulaires stables, transduction par rétrovirus ou lentivirus, ou transfection d’ARNm modifié.

Les systèmes d’expression de mammifères peuvent utiliser des lignées cellulaires transitoires ou stables, dans lesquelles la construction d’expression est intégrée au génome hôte. Alors que les lignées cellulaires stables peuvent être utilisées pendant plusieurs expériences, la production transitoire permet de générer de grandes quantités de protéines en une à deux semaines. Ces systèmes utilisent des cultures en suspension et peuvent atteindre des rendements de l’ordre du gramme par litre, contrairement aux lignées cellulaires de mammifères classiques qui présentent généralement une croissance lente et de faibles niveaux d’expression.

Expression protéique végétale

L’expression transitoire dans les plantes s’est imposée comme une plateforme prometteuse pour la production de nombreux vaccins, protéines thérapeutiques, enzymes et anticorps. Les systèmes d’expression végétaux présentent plusieurs avantages potentiels, notamment en matière de sécurité et de rentabilité pour la production de produits biologiquement actifs. De plus, ils permettent la réalisation de PTM eucaryotes, ce qui peut améliorer la fonctionnalité des protéines exprimées. Cet aspect est particulièrement important pour les protéines thérapeutiques et les enzymes humaines.

L’expression protéique acellulaire (CFPE) est une méthode de production utilisant la machinerie cellulaire de synthèse de l’ARN et des protéines dans un système dépourvu de membranes cellulaires et de génome fonctionnel. Cette approche in vitro permet l’expression flexible d’une grande diversité de protéines dans différentes conditions. Un avantage particulièrement intéressant de l’expression acellulaire est qu’elle permet de produire des protéines difficiles, voire impossibles, à exprimer dans des cellules vivantes, notamment lorsqu’elles présentent une toxicité. Bien que ces protéines soient peu compatibles avec les méthodes d’expression cellulaires, elles constituent fréquemment des cibles thérapeutiques ou présentent elles-mêmes un potentiel thérapeutique.

ALiCE® (Almost Living Cell-Free Expression) est une plateforme eucaryote d’expression protéique permettant une production à grande échelle. Le système combine les avantages de Nicotiana. Tabacum comme système d’expression végétal avec la rapidité de la CFPE. ALiCE® atteint en moyenne un rendement protéique d’environ 2 grammes par litre en seulement 48 heures. Pour des applications industrielles, le volume peut être augmenté jusqu’à 10 litres. ALiCE® est également capable d’ajouter aux protéines des PTM eucaryotes telles que des profils complexes de glycosylation.