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Immunohistochimie (IHC)

L'immunohistochimie (IHC) est une méthode qui permet de détecter des protéines ou d'autres antigènes dans des sections de tissu. À cet effet, les sections sont exposées à des anticorps marqués dirigés contre des épitopes de la protéine cible. Il est alors possible de visualiser une cible à l'aide d'un marqueur, par exemple, d'un colorant fluorescent, d'une enzyme, d'un traceur radioactif ou d'or colloïdal.

L'application des anticorps peut se faire de deux manières distinctes : par méthode directe, c'est-à-dire en liant un anticorps conjugué à un marqueur à sa substance cible, ou par méthode indirecte, en incubant l'anticorps primaire dans la substance cible, puis en liant un anticorps secondaire marqué à l'anticorps primaire.

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TABLE DES MATIÈRES


Conseil : le site anticorps-enligne.fr propose :



PRÉPARATION DU TISSU

La préparation de l'échantillon de tissu revêt une importance capitale car toute manipulation inappropriée est susceptible d'altérer la structure du tissu, de réduire l'affinité de liaison de l'anticorps, voire d'empêcher totalement la liaison. L'objectif est de préserver le tissu proche de ses conditions de vie réelle tout en empêchant l'autolyse et la dégradation dues à une prolifération bactérienne ou fongique. Pour ce faire, on utilise des fixateurs tels que le periodate lysine paraformaldéhyde (PLP) ou le formol. Le plus souvent, on utilise entre 4 % et 10 % (et jusqu'à 40 % dans certains cas) de formaldéhyde dans un tampon phosphate 0,1M (afin de stabiliser le pH).

Dans le cas des tissus ne tolérant pas d'être incubés dans le formaldéhyde, il est souvent possible de refroidir rapidement les échantillons dans de l'azote liquide, et de les couper en plusieurs sections. Les tissus incubés avec des fixateurs sont placés dans une matrice (de la paraffine par exemple) ou, après avoir été deshydratés, dans le l'alcool (isopropanol ou éthanol) avant d'être découpés en plusieurs sections. Dans le cas des tissus sensibles, il est conseillé d'utiliser un vibratome car il génère moins de stress physique pour les tissus.

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RÉCUPÉRATION DE L'ANTIGÈNE

Malgré des qualités de conservation supérieures, sur le plan de la morphologie, les échantillons fixés dans le formol et inclus dans la paraffine peuvent perdre une partie ou l'intégralité de leur immunoréactivité en raison de modifications structurelles de l'antigène ciblé. La détermination des antigènes et, par conséquent, de l'immunoréactivité, peut être améliorée grâce à diverses techniques. On distingue principalement deux approches distinctes, à savoir le traitement thermique, appelé « récupération d'épitopes induite par la chaleur » (HIER), et la « récupération d'épitopes induite par la protéolyse » (PIER). Pour appliquer ces techniques, les sections de tissu doivent avoir été déparaffinées et réhydratées au préalable.

La récupération HIER utilise ce que l'on désigne souvent comme une solution de récupération. Ce tampon préchauffé présente une composition et un pH variables, et est souvent constitué de TRIS hydrochloride (Tris-HCl) ou de citrate. Les échantillons émergés sont exposés à la chaleur pendant une durée variable (généralement, entre 10 et 60 minutes), avant d'être doucement refroidis. La chaleur elle-même peut être générée par autoclave, bain-marie, autocuiseur ou tout appareil similaire.

La récupération PIER utile des enzymes digestives, telles que la protéinase K, la trypsine, la pepsine et diverses autres protéinases. La durée d'incubation et les concentrations optimales doivent être testées. Pour la dernière série, il convient d'optimiser les spécificités de l'échantillon. Parfois, il peut être nécessaire de combiner les récupérations HIER et PIER pour révéler l'antigène suite à l'incubation dans le formol.

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MÉTHODES DE COLORATION

Méthode directe

Grâce à cette méthode, un anticorps marqué (avec un substrat chromogène par exemple) réagit directement avec l'antigène présent dans le tissu. L'avantage de cette méthode réside dans le fait qu'un seul anticorps est nécessaire, ce qui rend l'application rapide et ne génère que peu de liaisons non spécifiques. Cependant, puisque un seul anticorps se lie à un épitope, l'intensité du signal est faible. En présence de faibles quantités d'antigènes, il se peu que le signal soit trop faible.

Méthode indirecte (en deux étapes)

La méthode indirecte a été mise au point pour palier au problème de la faible intensité du signal de la méthode directe. L'anticorps primaire se lie à l'antigène, puis un anticorps secondaire (marqué) se lie à l'anticorps primaire. Le signal est amplifié du fait que plusieurs anticorps secondaires sont liés à un anticorps primaire unique. Autre avantage de cette méthode : un seul anticorps marqué est nécessaire pour différentes substances cibles, ce qui permet de réduire les coûts. Son inconvénient vient du fait que les liaisons non spécifiques sont plus fréquentes qu'avec la méthode directe.

Méthode en trois étapes

Pour amplifier davantage le signal, il est possible d'utiliser un anticorps supplémentaire qui vient se lier à l'anticorps secondaire. Cette méthode entraîne une troisième couche d'anticorps, qui sont tous marqués. Cette méthode peut être utile pour colorer les antigènes ayant un nombre d'épitopes limité.

Méthode PAP

Aujourd'hui, la méthode peroxydase anti-peroxydase est très peu utilisée, cependant, elle s'est auparavant révélée populaire dans les laboratoires de pathologie. Il s'agit d'une méthode indirecte qui se base sur une troisième couche d'anticorps, liés à la peroxydase, venant se lier à un anticorps de la deuxième couche non conjugué. La peroxydase n'est pas conjuguée chimiquement à l'IgG, mais est liée immunologiquement. Cela signifie que l'anticorps de la troisième couche est spécifique à la peroxydase. L'activité de la peroxydase est alors plus importante, ce qui accroît la sensibilité du dosage de deux ou trois ordres de grandeur.

Méthodes du complexe (strept)avidine-biotine (ABC)

De nos jours, l'une des méthodes les plus couramment employées pour la coloration se fonde sur l'affinité élevée de l'avidine (œuf de poulet) et la streptavidine (Streptomyces avidinii) vis-à-vis de la biotine. Le principe de base est que l'avidine (ou la streptavidine) réagit avec un anticorps secondaire biotynilé, ce qui s'ensuit d'une réaction à la peroxydase de raifort.

Dans certains cas, l'amplication catalysée du signal est utilisée. Un réactif d'amplification entraîne l'agrégation d'un grand nombre de biotines qui vont ensuite réagir avec la peroxydase marquée à la streptavidine. L'avidine pose toutefois un problème : sa grande liaison électrostatique, due à sa charge moléculaire. La streptavidine n'a pas la même prédisposition, ce qui permet de réduire le signal de fond.

Méthodes polymériques

En résumé, les méthodes polymériques utilisent de grands polymères liés à l'anticorps pouvant se lier à un grand nombre de molécules, selon une moyenne, en général, de dix anticorps pour 70 enzymes environ. Cette configuration permet d'amplifier considérablement le signal, et donc d'obtenir une sensibilité accrue, une réduction des liaisons non spécifiques et une diminution du signal de fond. Elle permet également la colorationsimultanée de deux antigènes différents.

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EXEMPLE DE COLORATION

Dans cet exemple, des cellules d'amygdale humaine ont été colorées pour détecter le . Les conditions suggérées dans ce cas précis sont décrites plus bas. Les conditions exactes d'une expérience donnée doivent toujours être déterminées par l'utilisateur.


Dilution : titre de 1:25-1:50 avec une méthode ABC.

Protocole de coloration : incubation de 30 minutes à température ambiante Les coupes de tissu fixées au formol et incluses dans la paraffine requièrent un démasquage antigénique haute température avec un tampon de citrate 10 mM, pH 6.0 avant l'immunocoloration.

Localisation cellulaire : membrane de la cellule.