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Protein Tags

La protéine fluorescente verte (GFP) est une protéine de la méduse Aequorea victoria qui émet une fluorescence verte lors de l'excitation par une lumière bleue ou ultraviolette. La découverte de la protéine fluorescente verte au début des années 1960 par Shimomura a jeté les bases de l'imagerie moderne des cellules vivantes. La GFP peut être fusionnée à d'autres protéines d'intérêt dans une cellule hôte comme marqueur fluorescent non invasif dans les cellules et organismes vivants.

Depuis lors, la GFP a été modifiée et perfectionnée pour produire une pléthore de mutants couvrant une large gamme de couleurs, notamment des protéines fluorescentes vertes, cyan et jaunes améliorées, qui présentent des longueurs d'onde d'émission maximales allant de 425 à 525 nm.

Propriétés spectroscopiques des variantes de la GFP, et anticorps respectifs contre les protéines marquées GFP.
Protéine Excitation [nm] Emission [nm] Extinction. Coeff. [M-1cm-1] Rendement quantique [Φ] Luminosité [nM-1cm-1]. t [0,5]Maturation (37 °C). Structure Anticorps
GFP (wt) 395 475 509 21 000 0,77 19,8 36 min Dimère ABIN100085
EGFP 484507 56.000 0,6 33,6 15 min Faible Dimer ABIN1169226
EBFP 383 445 29 000 0,31 6,9 Faible Dimer
ECFP 439 476 32 500 0,4 13 Monomère ABIN2688134
EYFP 514 527 83 400 0,61 44,9 9 min Faible Dimer ABIN2685914

Comme la construction de mutants décalés vers le rouge à partir de la méduse GFP de Aequorea victoria au-delà du spectre jaune s'est avérée largement infructueuse, les chercheurs ont cherché des options supplémentaires. En 1999, la protéine fluorescente rouge DsRed, dérivée des anémones de mer Discosoma, a été mentionnée pour la première fois dans une publication de Matz et al. Une fois complètement mature, le spectre d'émission de fluorescence de DsRed présente un pic à 583 nm alors que le spectre d'excitation présente un pic majeur à 558 nm et un pic mineur autour de 500 nm.

Balises de protéines fluorescentes: GFP vs RFP

Par rapport à la GFP, le DsRed de type sauvage présente certains inconvénients mais aussi des avantages uniques. Contrairement à la GFP, la fluorescence de DsRed reste stable dans des gammes de pH acides. En outre, le DsRed est particulièrement bien adapté à la microscopie à fluorescence, en raison de son bon contraste. De plus, il a un rendement quantique élevé et est photo stable. D'autre part, la maturation de la fluorescence du DsRed se produit lentement sur une période de 24 heures. Il ne peut donc pas être utilisé pour surveiller les protéines dont la demi-vie est courte. Le DsRed est un tétramère obligatoire et peut former de grands agrégats de protéines dans les cellules vivantes, ce qui présente un risque accru de toxicité. Dans l'ensemble, la GFP peut se conjuguer avec succès avec une plus grande variété de protéines.

Variantes de la RFP

Comme pour la GFP, plusieurs variantes de la RFP ont été conçues pour améliorer ses caractéristiques en général ou les optimiser pour des expériences spécifiques. DsRed2 contient plusieurs mutations à l'extrémité N-terminale qui empêchent la formation d'agrégats de protéines et réduisent la toxicité. L'émission de fluorescence rouge de DsRed-Express peut être observée dans l'heure qui suit l'expression, soit 11 fois plus vite que DsRed. DsRed-Express est un RFP précurseur de dérivés plus récents, notamment tdTomato et les monomères mCherry, mOrange et mStrawberry.

Propriétés spectroscopiques des variantes RFP, et anticorps respectifs contre les protéines marquées RFP.
Protéine Excitation [nm] Emission [nm] Extinction. Coeff. [M-1cm-1] Rendement quantique [Φ] Luminosité [nM-1cm-1] t [0,5]Maturation (37 °C) Structure Anti-corps
DsRed 558 583 75 000 0,68 49,3 26 h 40 min Tétramère ABIN129578
DsRed2 563 582 43 800 0,55 28,6 6 h 30 min Tétramère ABIN129578
DsRed-Express 555 584 38 000 0,42 12,64 42 min Tétramère ABIN129578
tdTomate 554 584 138 000 0,69 95,22 1 h Tandem Dimer ABIN6254170
mCherry 587 610 72 000 0,22 15,8 15 min Monomère ABIN1440058
mOrange 548 562 71 000 0,69 228 2 h 30 min Monomère ABIN2685914
LSSmOrange 437 572 52,000 0,45 23,4 2 h 20 min Monomère

mCherry est avec mOrange et mStrawberry un membre de la famille mFruits des protéines fluorescentes rouges monomères. Par rapport au progéniteur DsRed, mOrange, mStrawberry et mCherry produisent des variantes fortement décalées vers le bleu et le rouge. Elles ont un poids moléculaire plus faible et se replient plus rapidement que les tétramères, ce qui perturbe moins le système cible. Parmi tous les monomères véritables mis au point, le mCherry est celui qui présente les plus grandes longueurs d'onde, la photostabilité la plus élevée, la maturation la plus rapide et une excellente résistance au pH. Le mOrange surpasse le mCherry en termes de rendement quantique, mais il présente une sensibilité importante aux acides. Un coefficient d'extinction et un rendement quantique élevés font de la variante à grand décalage de stoke LSSmOrange (en combinaison avec le T-Sapphire) un candidat approprié pour les applications FRET.

tdTomato est une fusion génétique de deux copies du gène dTomato qui a été spécifiquement conçue pour une faible agrégation. Sa structure dimère en tandem joue un rôle important dans la luminosité exceptionnelle de tdTomato, qui est 5 fois supérieure à celle de l'EGFP. La longueur d'onde d'émission de tdTomato (581 nm) et sa luminosité en font un produit idéal pour les études d'imagerie animale en direct. Comme tdTomato forme un dimère intramoléculaire, il se comporte comme un monomère et est aussi photostable que mCherry.

Protéines fluorescentes phototransformables

Dendra2 est une version améliorée de la protéine fluorescente photoswitchable vert-rouge Dendra, dérivée des espèces d'octocoral Dendronephthya. Dendra2 présente une maturation plus rapide et une fluorescence plus brillante avant et après le photoswitch que celle de Dendra. Contrairement à tous les autres FP monomères photoactivables, qui nécessitent nécessairement une lumière UV-violette (par exemple, un laser de 405 nm) pour l'activation, Dendra et Dendra2 permettent l'utilisation d'une lumière d'activation bleue (par exemple, un laser de 488 nm). La propriété de phototransformation a permis de mettre en évidence et de suivre des sous-populations de cellules, d'organites et de protéines dans les systèmes vivants. Avec Dendra2, les protéines nouvellement synthétisées qui sont en route vers leur destination finale peuvent être visualisées.

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Protéine fluorescente photocommutable Dendra2 : propriétés spectroscopiques , et anticorps contre les protéines marquées Dendra2
Protéine Excitation [nm] Emission [nm] Extinction. Coeff. [M-1cm-1]. Rendement quantique [Φ] Luminosité [nM-1cm-1]. t [0,5]Maturation (37 °C). Structure Anticorps
Dendra2 490 507 45 000 0,50 23 Monomère ABIN361314
553 573 35 000 0,55 19

Les tags protéiques sont diverses séquences d'acides aminés, le plus souvent courtes, qui peuvent être utilisées pour marquer les protéines. Le tag est fusionné à une protéine recombinante par génie génétique. En général, les étiquettes protéiques sont utilisées pour la purification et la détection par chromatographie d'affinité, les tests pull-down, le western blot, l'immunohistochimie, la microscopie à fluorescence ou l'imagerie en direct. En raison de leur structure, les étiquettes ont des propriétés différentes et, par conséquent, des domaines d'application différents. Les étiquettes sont généralement placées sur l'extrémité N- ou C- afin de minimiser les perturbations de la structure tertiaire susceptibles d'altérer la fonction de la protéine. Souvent, un site de clivage protéasique peut être inséré entre la protéine recombinante et le tag pour dissocier protéolytiquement le tag après purification.

Qu'est-ce que les balises d'affinité?

Les étiquettes d'affinité sont attachées aux protéines pour faciliter la purification à partir de leur source biologique en utilisant une technique d'affinité. Il s'agit par exemple du Strep tag et du AVI Tag qui ont tous deux une forte affinité pour la biotine. La liaison de la biotine à la streptavidine/avidine est l'une des plus fortes interactions non covalentes connues dans la nature.

Le tag poly(His) est un tag protéique largement utilisé, qui se lie aux ions métalliques divalents immobilisés sur des matrices en phase solide. Les protéines marquées His présentent une polarité accrue. Dans des conditions alcalines, les résidus d'histidine chélatent l'ion métallique et se lient au support.

Balises de protéines de fusion

Certaines étiquettes d'affinité comme la protéine de liaison au maltose (MBP) ou la glutathion-S-transférase (GST) ne sont pas de courtes séquences AA mais de grandes protéines de fusion. Outre la purification, elles ont un double rôle d'agent de solubilisation. Elles assurent le repliement correct des protéines exprimées dans des espèces déficientes en chaperons comme E. coli et empêchent la précipitation.

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Comparaison des étiquettes d'affinité, et des anticorps respectifs contre les protéines marquées.
Tag Séquence Matrix Pros Cons Anticorps
GST 211 AA Glutathion Soutient le repliement, stabilise la protéine, l'activité enzymatique permet d'estimer le rendement Grand, uniquement purification native, uniquement N-terminal ABIN1573889
MBP 396 AA Maltose Soutient le repliement Grand, uniquement purification native ABIN103913
HIS HHHHHHH Ni2+ Résine d'affinité réglable, fonctionne dans des conditions de dénaturationchargée, sensibilité (EDTA, DTT, métalloprotéines), optimisation de l'élution ABIN1573881
AVI GLNDIFEAQKIEWHE Avidine Haute spécificité, conditions douces ABIN1574261
Strep WAHPQPGG Streptavidine Haute spécificité, non chargé, bonne purification, élution en une étape Uniquement purification native ABIN3181089
StrepII WSHPQFEK Strep-Tactin Haute spécificité, non chargé, bonne purification, élution en une étape ABIN1573896

Qu'est-ce que les balises épitopes ?

Les étiquettes épitopes sont des épitopes artificiels, qui sont clonés dans le cadre de la séquence codante de la protéine d'intérêt. Les étiquettes épitopes sont généralement composées de squenences d'acides aminés de 10 à 15 acides aminés de longueur. En raison de leur taille relativement petite, ils n'ont pratiquement aucun effet sur la structure de la protéine de fusion résultante. La plupart des marqueurs épitopes sont dérivés de gènes viraux, ce qui explique leur forte immunoréactivité. Ces étiquettes sont particulièrement utiles pour les expériences de western blotting, d'immunofluorescence et d'immunoprécipitation, bien qu'elles soient également utilisées pour la purification des anticorps. Les exemples sont Myc-tag, HA-tag, Spot-tag, ou V5-tag.

Le tag DYKDDDDK, également connu sous le nom de tag FLAG® est l'un des tags épitopes les plus spécifiques créés artificiellement. La structure de la balise FLAG a été optimisée pour être compatible avec les protéines auxquelles elle est attachée. Sa nature hydrophile minimise les effets sur la fonction, la sécrétion ou le transport de la protéine de fusion.

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Comparaison des étiquettes épitopes, et des anticorps respectifs contre les protéines étiquetées.
Tag Séquence Matrix Pros Cons Anti-corps
HA YPYDVPDYA mAb Faible interférence avec la structure de la protéine, le tag Poly-HA augmente la capacité de liaison Pas de purification des cellules apoptotiques ABIN2443910
Myc CEQKLISEEDL mAb Faible interférence avec la structure protéique Peut interférer avec la translocation des protéines sécrétoires ABIN1573879
V5 GKPIPNPLLGLDST mAb La faible interférence avec la structure de la protéine ABIN3181078
DYKDDDDK DYKDDDDK Abm Faible interférence avec la structure des protéines, haute spécificité, bonne purification Capacité de liaison limitée ABIN99294

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