Antibody and immunoglobulin alternatives (Part 2)

Alternatives non dérivées des Ig

La caractéristique commune des mimétiques d’anticorps réside dans l’objectif de fournir des alternatives présentant des performances similaires ou supérieures à celles des anticorps. Leurs origines sont très diverses et, par conséquent, une large gamme de plateformes structurellement très hétérogènes est disponible. De manière générale, ces alternatives sont constituées de courtes chaînes polypeptidiques ou oligonucléotidiques qui adoptent une conformation simple et thermodynamiquement stable. Elles doivent tolérer les substitutions d’acides aminés ou de nucléotides au sein de leurs régions de liaison à la cible afin de permettre le criblage de bibliothèques combinatoires.

Nombre de ces mimétiques d’anticorps sont dépourvus de ponts disulfure et peuvent donc être produits dans les conditions réductrices du cytoplasme. Cette caractéristique, associée à l’absence de modifications post-traductionnelles, élargit la gamme des systèmes d’expression disponibles, notamment aux systèmes bactériens peu coûteux. En outre, une reproductibilité accrue et la possibilité de développer des ligands dirigés contre des cibles difficiles figurent parmi les principaux avantages des alternatives aux anticorps non dérivées des Ig.

Outre leur production, le stockage de ces produits est également souvent plus simple que celui des anticorps, car ils restent stables dans des conditions qui dénatureraient ou endommageraient des anticorps conventionnels. À cette fin, les alternatives aux anticorps reposent sur un échafaudage biologiquement inerte favorisant la formation de structures capables de fournir une vaste surface d’interaction pour une liaison étroite. Des régions modifiables établissent les contacts spécifiques avec la cible concernée, avec des affinités souvent comprises entre le domaine nanomolaire et picomolaire. Les répétitions doivent s’auto-organiser, idéalement sans nécessiter de ponts disulfure. Les résidus structuraux doivent être distincts de ceux responsables de la spécificité afin de permettre une ingénierie directe de la spécificité de la protéine sans compromettre son intégrité structurale.

Leur aptitude à l’ingénierie découle également du fait que ces échafaudages destinés aux ligands spécifiques permettent de contourner certaines contraintes de propriété intellectuelle. Les médicaments à base d’anticorps sont largement protégés par des brevets, ce qui rend difficile pour les entreprises pharmaceutiques l’élargissement de leur utilisation. En raison de leur petite taille, certains mimétiques d’anticorps doivent être fusionnés à un transporteur tel qu’une IgG afin de ralentir leur clairance rénale et d’obtenir les propriétés pharmacocinétiques souhaitées.

Les alternatives non dérivées des Ig ne sont pas encore utilisées à la même échelle que les immunoglobulines conventionnelles. Cette situation pourrait toutefois évoluer dans un avenir proche, aussi bien pour les applications cliniques que pour la recherche. Il existe une multitude de domaines protéiques naturels pouvant être utilisés pour l’ingénierie de ligands spécifiques, notamment :

• Aptamères
• DARPins
• Affimers
• Avimers
• Knottines
• Monobodies
• Affinity clamps

Aptamères

Les aptamères sont des ligands à base d’acides nucléiques ou de peptides qui reconnaissent spécifiquement des protéines, des acides nucléiques et d’autres molécules. Des cellules entières et même des tissus peuvent également constituer leurs cibles. Les aptamères d’acides nucléiques sont développés par SELEX ou sélection in vitro. Les X-aptamères incorporent des nucléotides chimiquement modifiés et des structures d’ADN afin d’élargir la gamme des cibles potentielles ou d’augmenter l’affinité et la spécificité. Toutefois, pour cette même raison, il n’est pas possible d’appliquer les mêmes mécanismes d’amplification et de sélection que pour les aptamères d’ARN et d’ADN. À l’inverse, les aptamères peptidiques sont constitués d’une région en boucle variable reliée à ses deux extrémités à une grande protéine d’échafaudage afin d’assurer sa solubilité.

Traditionnellement, une bibliothèque d’expression peptidique randomisée est présentée par la protéine thiorédoxine A (TrxA) d’E. coli. D’autres échafaudages tels que la GFP ont également été utilisés. Les aptamères présentant la spécificité souhaitée sont sélectionnés à l’aide du système double hybride de levure ou de techniques d’affichage établies.

Les Slow Off-rate Modified Aptamers (SOMAmers¹) constituent une classe particulière d’aptamères composée d’une courte séquence d’ADN incorporant plusieurs bases modifiées dotées de chaînes latérales semblables à celles des protéines. Ils exploitent ainsi le potentiel des modifications synthétiques des nucléotides pour conférer à un échafaudage d’acide nucléique des caractéristiques et une diversité semblables à celles des protéines.

DARPins²

Les Designed Ankyrin Repeat Proteins reposent sur la structure des ankyrines naturellement présentes, une classe de protéines qui assurent la fixation des protéines membranaires intégrales au cytosquelette membranaire. Elles sont généralement composées de quatre à six répétitions de 33 acides aminés, chacune constituée d’un coude β suivi de deux hélices α antiparallèles.

Tout en conservant comme échafaudage les résidus conservés importants pour la structure, les DARPins se prêtent particulièrement bien à l’ingénierie des résidus entrant en contact avec le partenaire de liaison, notamment au moyen de méthodes de ribosome display ou de phage display.

Les modules sont maintenus ensemble par des interactions hydrophobes, à l’exception des extrémités N- et C-terminales hydrophiles, ou « caps », exposées au solvant. En raison du fort couplage entre les répétitions, les DARPins comportant au moins quatre répétitions internes présentent une résistance élevée à la dénaturation et s’expriment efficacement dans E. coli ainsi que dans les systèmes d’expression acellulaires.

Affimers

La conception rationnelle d’un nouvel échafaudage destiné à présenter des peptides contraints, sur la base des propriétés recherchées pour les mimétiques d’anticorps, a conduit au développement des Affimers basés sur la stefín A humaine (SteA). Leur triple mutant de stefín A (STM) est constitué de 98 acides aminés en une seule chaîne et ne présente aucune modification post-traductionnelle³. En outre, la stabilité de la conformation n’est pas affectée par l’insertion d’un peptide conférant à la protéine sa spécificité envers la cible. Ces Affimers basés sur STM sont considérés comme des Affimers de type I.

Les Affimers de type II sont basés sur la cystatine, un inhibiteur de cystéine protéase⁴. Dans ce cas, la cystatine sert d’échafaudage pour présenter deux boucles et une région N-terminale variable qui confèrent sa spécificité à la protéine. Les deux boucles peuvent s’étendre chacune sur 12 à 36 acides aminés et créent ainsi une vaste interface d’interaction avec l’antigène ciblé. L’étendue de cette interface est responsable de la grande spécificité et de la forte affinité de liaison.

Avimers⁵

Les multimères d’avidité sont dérivés de domaines A humains présents dans différents récepteurs de surface cellulaire. Ils sont constitués de deux ou plusieurs séquences peptidiques de 30 à 35 acides aminés, chacune reconnaissant un épitope différent. Ils forment ainsi des protéines capables de se lier à plusieurs sites sur une ou plusieurs cibles avec des affinités pouvant atteindre le domaine picomolaire. Les différents domaines sont générés par brassage d’exons et par des sélections successives.

La structure de chaque « monomère » est définie par quatre résidus de liaison au calcium, deux résidus d’échafaudage et six cystéines formant trois ponts disulfure. Fait remarquable, ces ponts disulfure peuvent être formés avec succès après oxydation, et les sous-unités peuvent adopter leur conformation correcte après production dans le cytoplasme d’E. coli.

Knottines⁶

Les knottines sont de petites protéines riches en ponts disulfure comportant au moins trois ponts disulfure et caractérisées par un nœud disulfure en forme de trèfle. Cette structure centrale leur confère une grande résistance à la protéolyse et aux variations thermiques, tandis que des boucles exposées assurent la spécificité envers la cible d’intérêt. Grâce à leur petite taille de seulement quelques kDa, les knottines présentent un potentiel considérable comme médicaments et comme nouveaux réactifs d’imagerie moléculaire.

Monobodies⁷

Malgré leur nom, les monobodies ne sont pas des dérivés d’anticorps. Ils utilisent à la place le domaine de type III de la fibronectine humaine (FN3) comme échafaudage sur lequel peuvent être greffées des boucles assurant la reconnaissance spécifique de la cible. L’échafaudage FN3 comprend 94 acides aminés et ressemble au domaine VH des anticorps. Il ne contient toutefois aucun pont disulfure. Sa spécificité de liaison peut être facilement modifiée à l’aide de techniques de phage display et de yeast display.

Affinity clamps⁸

Ces protéines de liaison recombinantes combinent deux domaines protéiques reliés par une région charnière et qui se referment comme une « pince » sur de courts motifs peptidiques. Les deux domaines agissent en synergie pour atteindre des niveaux de spécificité et d’affinité qu’aucun des deux domaines ne pourrait atteindre isolément. Leur spécificité est suffisamment élevée pour capturer une seule cible peptidique dans l’environnement cellulaire. La spécificité et l’affinité du domaine d’interaction et du domaine amplificateur peuvent être modifiées par des cycles itératifs de mutation et de sélection.

Conclusion

Cette liste ne peut donner qu’un aperçu de la diversité des plateformes actuellement disponibles comme mimétiques d’anticorps. Elle est loin d’être exhaustive et omet même certains échafaudages déjà bien établis tels que les affilines⁹, les affibodies dérivés de la protéine A¹⁰ et les anticalines apparentées aux lipocalines¹¹.

À l’heure actuelle, seules quelques-unes de ces plateformes ont donné naissance à des ligands spécifiques facilement disponibles pour les applications de recherche. Cependant, les efforts de recherche et développement consacrés à ces différentes alternatives aux anticorps se sont essentiellement concentrés sur les 25 dernières années. On ne peut qu’imaginer les possibilités que ces molécules pourraient offrir au cours des 100 prochaines années, aussi bien comme agents thérapeutiques que comme réactifs de recherche.

Informations complémentaires

Alternatives aux immunoglobulines conventionnelles (Partie 1)

Références