An Introduction to ELISA (Part 2)

L'ELISA est une technique particulièrement puissante et polyvalente, qui peut être mise en œuvre selon plusieurs formats. Cet article présente les principaux formats ELISA disponibles dans le commerce et explique leurs différences spécifiques.

Si vous recherchez une introduction générale à l'ELISA et souhaitez déterminer si cette méthode est adaptée à votre expérience, consultez Introduction à l'ELISA (Partie 1).

ELISA direct

L'ELISA direct est le format ELISA le plus simple. Dans un ELISA direct :

• L'analyte est immobilisé sur un support solide, le plus souvent une plaque de microtitration à 96 puits.
• Un anticorps conjugué à une enzyme et dirigé contre l'antigène est ajouté à la plaque.
• L'anticorps reconnaît l'analyte immobilisé et s'y lie ; tout anticorps non lié est ensuite éliminé par lavage.
• Un substrat chromogène incolore tel que TMB (3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine) est ajouté.
• Le conjugué enzymatique réagit avec le substrat chromogène et le transforme en un produit fortement coloré.
• L'intensité du changement de couleur est mesurée à l'aide d'un lecteur de plaque spectrophotométrique.

Il est important de garder à l'esprit que l'enzyme catalysant la réaction colorimétrique est conjuguée à un anticorps, lui-même lié à l'antigène immobilisé sur la plaque. La vitesse de réaction dépend donc de la quantité d'enzyme présente, qui dépend elle-même de la quantité d'analyte liée à la plaque et de l'affinité de l'anticorps pour cet analyte.

Les ELISA directs sont rarement proposés sous forme commerciale, principalement parce que l'objectif de la plupart des utilisateurs est de confirmer la présence et de mesurer la concentration d'un analyte dans un échantillon biologique complexe. La nature de la matrice de ces échantillons empêche souvent leur immobilisation directe sur une plaque ou un autre support solide. Un chercheur peut cependant choisir un ELISA direct s'il souhaite évaluer l'efficacité d'un nouvel anticorps contre une cible connue pouvant être immobilisée sur une plaque de microtitration, ou comparer la concentration d'une protéine recombinante purifiée à une série de standards de concentrations connues.

ELISA indirect

L'ELISA indirect est une variante de l'ELISA direct. Le principe est identique, à l'exception de l'étape de détection. Dans un ELISA indirect, l'anticorps primaire utilisé pour détecter l'analyte n'est pas conjugué à une enzyme. À la place, un anticorps secondaire conjugué à une enzyme et réactif vis-à-vis de l'anticorps primaire est ajouté.

L'utilisation d'un anticorps secondaire présente dans un ELISA de nombreux avantages similaires à ceux observés dans d'autres méthodes de protéomique. En plus d'éviter au chercheur le processus parfois complexe de conjugaison d'un anticorps primaire, un anticorps secondaire peut amplifier un signal faible, permettant de visualiser un signal auparavant indétectable et d'abaisser le seuil de détection du test.

ELISA sandwich (capture)

La plupart des ELISA disponibles dans le commerce utilisent un format sandwich. Ce format doit son nom au fait que l'analyte est « pris en sandwich » entre deux anticorps différents. Dans un ELISA sandwich :

• L'analyte n'est PAS directement immobilisé sur la plaque.
• Un anticorps de « capture » est immobilisé à la surface des puits de la plaque.
• L'anticorps de capture lie et retient l'analyte présent dans l'échantillon. Les autres composants de la matrice sont éliminés par lavage.
• Un anticorps de « détection » conjugué à une enzyme et dirigé contre un autre épitope de l'analyte est ajouté à la plaque.
• La méthode de détection colorimétrique standard décrite précédemment est utilisée pour détecter et quantifier l'analyte dans l'échantillon.

Un anticorps monoclonal est souvent choisi comme anticorps de capture dans un ELISA sandwich. Par nature, les anticorps monoclonaux ne reconnaissent qu'un seul épitope d'un antigène. Cette propriété permet généralement d'augmenter la spécificité du test et de réduire le bruit de fond, ce qui les rend particulièrement intéressants pour la conception d'un assay.

L'utilisation d'anticorps monoclonaux à la fois pour la capture et pour la détection dans un ELISA sandwich n'est généralement pas recommandée. À moins que les épitopes reconnus par les anticorps de capture et de détection aient été précisément cartographiés, il est difficile, voire impossible, de prévoir si l'anticorps de capture empêchera la liaison de l'anticorps de détection en raison d'un encombrement stérique. La constante de liaison d'un anticorps monoclonal individuel est également souvent inférieure à celle des meilleurs anticorps présents dans un mélange hétérogène d'anticorps polyclonaux. Par conséquent, un assay conçu exclusivement avec des anticorps monoclonaux risque d'être moins sensible qu'un assay utilisant au moins un anticorps polyclonal.

Comme pour les autres formats, la détection dans un ELISA sandwich peut être directe ou indirecte, c'est-à-dire que l'anticorps de détection peut être directement marqué ou qu'un anticorps secondaire conjugué et réactif vis-à-vis de l'anticorps de détection peut être utilisé. Si une méthode de détection indirecte est choisie, il est essentiel de s'assurer que l'anticorps secondaire réagit uniquement avec l'anticorps de détection et non avec l'anticorps de capture immobilisé sur la plaque.

ELISA compétitif

L'ELISA compétitif est probablement l'un des formats les plus difficiles à appréhender. Dans un assay compétitif, lorsque la concentration d'antigène dans l'échantillon augmente, l'intensité du signal diminue. Dans un ELISA compétitif :

• Un standard antigénique est immobilisé à la surface de la plaque.
• Un anticorps dirigé contre l'analyte est incubé avec l'échantillon.
• L'analyte présent dans l'échantillon se lie aux anticorps en solution et occupe leurs sites de liaison.
• Le mélange anticorps/échantillon est ensuite ajouté aux puits recouverts d'antigène.
• Les anticorps libres, qui n'ont pas lié l'analyte présent dans l'échantillon, se lient au standard antigénique immobilisé sur la plaque.
• Les anticorps occupés, qui ont déjà lié l'analyte présent dans l'échantillon, sont éliminés par lavage.
• Une méthode de détection colorimétrique standard est utilisée pour détecter et quantifier l'analyte dans l'échantillon.

Le principe central de l'ELISA compétitif est qu'une concentration plus élevée d'analyte dans l'échantillon entraîne une quantité plus faible d'anticorps libres en solution et, par conséquent, un nombre réduit d'anticorps marqués liés au standard immobilisé sur la plaque, ce qui produit un signal moins intense.

Le principal avantage d'un ELISA compétitif par rapport à un ELISA sandwich est qu'un seul anticorps doit se lier à l'analyte pour permettre sa détection. Le format compétitif constitue donc une option intéressante lorsqu'aucune paire d'anticorps adaptée ne peut être identifiée pour un ELISA sandwich ou lorsque l'analyte est trop petit pour permettre la liaison simultanée d'un anticorps de capture et d'un anticorps de détection.

ELISA par inhibition compétitive

La plupart des kits ELISA compétitifs disponibles dans le commerce, y compris ceux proposés par antibodies-online, utilisent un format d'inhibition compétitive. Les ELISA par inhibition compétitive diffèrent légèrement des ELISA compétitifs classiques. Dans ce format, un anticorps de capture est immobilisé sur une plaque à 96 puits, de manière similaire à un ELISA sandwich. L'antigène non marqué présent dans l'échantillon et une concentration connue d'un standard antigénique marqué, conjugué à la HRP ou à un système de détection comparable, entrent ensuite en compétition pour la liaison à l'anticorps immobilisé.

Dans un ELISA par inhibition compétitive, comme dans un ELISA compétitif classique, le signal résultant du changement de couleur est inversement proportionnel à la quantité d'antigène présente dans l'échantillon. Une grande quantité d'antigène dans l'échantillon entraîne la liaison d'une quantité plus faible de standard marqué aux anticorps immobilisés sur la plaque et donc un signal plus faible. À l'inverse, une faible quantité d'antigène dans l'échantillon permet à une plus grande quantité de standard marqué de se lier à la plaque, produisant ainsi un signal colorimétrique plus intense.

Conclusion

L'ELISA est une méthode rapide, simple et puissante qui présente de nombreux avantages par rapport à d'autres techniques couramment utilisées en protéomique. Nous espérons que cet article vous a permis de mieux comprendre les différents formats ELISA disponibles dans le commerce et vous aidera à déterminer si l'ELISA est adapté à votre expérience. Si vous avez encore des questions concernant cette méthode ou toute autre technique, n'hésitez pas à contacter l'un de nos scientifiques du support technique. Ils se feront un plaisir de vous aider à identifier le produit le mieux adapté à vos besoins.

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