Les Nanodiscs sont des structures artificielles qui reproduisent la bicouche phospholipidique entourant chaque cellule vivante. Ils permettent la reconstitution et la stabilisation des protéines membranaires (MP) dans une conformation native, facilitant ainsi les études fonctionnelles de ces cibles thérapeutiques importantes. Les Nanodiscs pourraient également ouvrir la voie à l’utilisation de protéines membranaires dans de futurs tests diagnostiques.
- Que sont les Nanodiscs ?
- Pourquoi utiliser des Nanodiscs ?
- Quel type de Nanodisc pour quelle protéine ?
- Applications des Nanodiscs
- Nanodiscs MSP
- Nanodiscs MSP disponibles
- Variants des protéines d’échafaudage
- Assemblage des Nanodiscs MSP
- Phospholipides
- Nanodiscs synthétiques
- Nanodiscs synthétiques disponibles
Que sont les Nanodiscs ?
Les Nanodiscs suscitent un intérêt croissant en raison de leur capacité à reproduire l’environnement lipidique naturel et à fournir une plateforme stable pour les protéines membranaires. Les Nanodiscs à membrane scaffold protein (MSP), illustrés dans la figure 1, sont constitués d’une bicouche synthétique de phospholipides (rouge) maintenue par un anneau de MSP (bleu), permettant la reconstitution de protéines membranaires (bleu foncé).
Dans un Nanodisc, la bicouche phospholipidique synthétique est maintenue par un anneau formé de deux molécules d’une membrane scaffold protein (MSP) hélicoïdale amphipathique dérivée de l’apolipoprotéine A-I d’origine humaine, murine ou de rat (fig. 1). Les régions lipophiles des protéines membranaires étant masquées à l’intérieur de la bicouche lipidique, ces protéines peuvent être purifiées par des méthodes chromatographiques classiques sans ajout de détergent.
Pour la purification, la protéine membranaire elle-même peut être marquée par un tag, ou le His-tag fusionné à la MSP peut être utilisé. Les complexes protéine membranaire–Nanodisc présentent une stabilité accrue par rapport aux protéines membranaires solubilisées avec des détergents.
Pourquoi utiliser des Nanodiscs ?
Les Nanodiscs ne sont pas la seule solution pour étudier des protéines membranaires actives et correctement repliées. Ils présentent toutefois plusieurs avantages par rapport aux méthodes couramment utilisées :
Détergent
- + maintient les protéines membranaires en solution
- + grande diversité de détergents
- - effet négatif possible sur la stabilité et/ou l’activité des protéines membranaires – optimisation nécessaire
- - effet marqué de la courbure membranaire
- - interférence possible avec de nombreux tests – optimisation nécessaire
- - concentration difficile à déterminer
- - artefacts optiques (absorbance, diffusion de la lumière)
Liposome
- + bicouche phospholipidique
- + permet la compartimentation (p. ex. pour les canaux ioniques)
- - incompatible avec la cristallisation ; difficile en RMN
- - structure volumineuse et instable
- - préparation difficile (taille définie, stœchiométrie)
Nanodisc
- + auto-assemblage dans un environnement lipidique proche de l’état natif
- + absence de courbure membranaire
- + soluble dans l’eau
- + choix flexible des phospholipides / maintien de la composition lipidique de la membrane d’origine
- + taille variable et définie (variants MSP)
- + adapté à un large éventail d’études biophysiques et biochimiques, notamment la RMN et la SPR
- + mesure des interactions des deux côtés de la membrane
- - absence de compartimentation ; mesure de l’activité des canaux ioniques difficile
Variants des protéines d’échafaudage
Le variant de protéine d’échafaudage le plus couramment utilisé pour les Nanodiscs est MSP1D1. Cette protéine comprend dix hélices α similaires à celles de l’Apo A-I, mais possède une extrémité N-terminale modifiée et confère au disque assemblé une meilleure stabilité que la MSP1 d’origine. MSP1D1-deltaH5 correspond à MSP1D1 avec une délétion de l’hélice 5, produisant ainsi un complexe Nanodisc de plus petit diamètre, mieux adapté notamment aux études RMN. MSP1E3D1 est au contraire prolongée par la duplication de trois hélices, tandis que MSP2N2 correspond à une MSP1D1 complète fusionnée, via un court linker, à une protéine MSP1D2 tronquée. Ces formes allongées permettent la formation de Nanodiscs de plus grand diamètre, adaptés à l’incorporation de complexes protéiques plus volumineux.
Assemblage des Nanodiscs MSP
Les Nanodiscs s’auto-assemblent à partir d’un mélange de MSP, de phospholipides et de détergent lorsque le détergent est éliminé. Le rapport optimal phospholipides/MSP constitue un paramètre critique pour assurer un auto-assemblage complet et obtenir des Nanodiscs de taille homogène. Ce rapport varie selon la MSP et le phospholipide utilisés. Un contrôle précis du rapport molaire entre la protéine cible, la MSP et les lipides permet également d’assembler des Nanodiscs présentant différents états oligomériques de la protéine membranaire (5).
| MSP1D1 | MSP1E3D1 | Incubation à | |
|---|---|---|---|
| DPPC | 90:1 | 170:1 | 37°C |
| DMPC | 80:1 | 150:1 | 25°C |
| POPC | 65:1 | 130:1 | 4°C |
Les protéines membranaires purifiées se reconstituent spontanément après l’ajout de MSP et de phospholipides puis l’élimination du détergent. Dans le cas de protéines membranaires, les phospholipides natifs de la membrane peuvent également former la bicouche du Nanodisc entourant la protéine après assemblage. La présence de phospholipides natifs peut avoir un effet favorable sur l’activité et la structure de la protéine. De plus, la durée d’exposition de la protéine solubilisée au détergent est considérablement réduite.
Pour reconstituer des protéines membranaires dans des Nanodiscs, la protéine peut être exprimée dans un système acellulaire en présence de Nanodiscs déjà assemblés (fig. 2A). Une autre possibilité consiste à solubiliser la protéine purifiée avec un détergent approprié (fig. 2B), puis à ajouter des MSP et des phospholipides ; les Nanodiscs contenant la protéine membranaire se forment alors spontanément. Une troisième option consiste à reconstituer directement la protéine d’intérêt dans un Nanodisc à partir de membranes (fig. 2C). Les complexes protéine–Nanodisc peuvent être purifiés des composants de la membrane d’origine par chromatographie d’affinité via le His-tag de la MSP. Le temps d’exposition au détergent est nettement plus court pour l’approche C que pour l’approche B.
Phospholipides
La bicouche phospholipidique du Nanodisc peut être composée de différents phospholipides ou mélanges de phospholipides afin de s’adapter au mieux à la protéine d’intérêt. Le choix des lipides dépend fortement de la protéine et peut influencer significativement son activité. En outre, les protéines provenant d’espèces différentes peuvent nécessiter des environnements phospholipidiques spécifiques : une protéine membranaire humaine requiert par exemple généralement un environnement différent de celui d’une protéine membranaire bactérienne. Il est donc recommandé de tester plusieurs phospholipides.
Parmi les phospholipides couramment utilisés figurent la palmitoyl-oléoyl-phosphatidylcholine (POPC), la dimyristoyl-glycéro-phosphocholine (DMPC), le dimyristoyl-phosphatidylglycérol (DMPG) et la 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPPC). De nombreux autres phospholipides sont également disponibles afin d’adapter au mieux l’environnement aux caractéristiques de la protéine d’intérêt.
Nanodiscs synthétiques
Contrairement aux Nanodiscs MSP, les Nanodiscs synthétiques sont formés à l’aide de polymères synthétiques, généralement des copolymères styrène-acide maléique (SMA) et de l’acide diisobutylène-maléique (DIBMA). Chaque polymère présente des avantages et des limites spécifiques. Le DIBMA, par exemple, n’absorbe pas la lumière à 280 nm et est donc particulièrement adapté à l’analyse des protéines par des techniques spectroscopiques. L’assemblage des Nanodiscs synthétiques débute avec des cellules intactes : les longues chaînes polymériques s’intègrent dans la membrane cellulaire autour des protéines membranaires cibles. Cette interaction extrait les protéines de la membrane et permet leur solubilisation dans la solution polymérique. L’interaction polymère-protéine stabilise ensuite les protéines membranaires dans les Nanodiscs nouvellement formés. L’utilisation de polymères synthétiques offre ainsi une grande flexibilité et un contrôle accru pour stabiliser et analyser les protéines membranaires dans de nombreuses applications biochimiques et biophysiques.
Variants de Nanodiscs synthétiques disponibles
antibodies-online propose différents Nanodiscs synthétiques. Contrairement à de nombreux Nanodiscs MSP disponibles sur le marché, nos Nanodiscs synthétiques peuvent être préparés directement à partir des cellules. Les polymères utilisés remplissent une double fonction : ils solubilisent la membrane cellulaire à la manière d’un détergent et utilisent simultanément les phospholipides cellulaires pour former des Nanodiscs autour des protéines membranaires. Les Nanodiscs contenant la protéine cible peuvent ensuite être purifiés.
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Quel type de Nanodisc pour quelle protéine ?
Bien que les Nanodiscs MSP et synthétiques aient tous deux pour objectif la solubilisation et la stabilisation des protéines membranaires, ils présentent des différences importantes qui déterminent leurs domaines d’utilisation privilégiés. Le tableau ci-dessous compare ces deux formats et facilite le choix du Nanodisc le mieux adapté à chaque application.
| Protéine Nanodisc MSP | Protéine Nanodisc synthétique | |
|---|---|---|
| Stabilisateur | MSP | Polymère |
| Taille | 7–17 nm | environ 10 nm |
| Composition lipidique | environnement phospholipidique artificiel | lipides natifs de membrane cellulaire |
| Source des protéines | Protéines issues d’une réaction acellulaire ou d’une méthode de solubilisation par détergent | directement à partir des cellules |
| Utilisation de détergent | Un détergent peut être utilisé lors de la préparation des protéines | sans détergent |
Les Nanodiscs MSP présentent une taille uniforme, ce qui les rend particulièrement adaptés à des applications telles que la cryo-EM. Les Nanodiscs à base de polymères peuvent en revanche nécessiter un screening supplémentaire, car le diamètre des polymères utilisés pour leur formation peut varier.
Une difficulté importante des Nanodiscs MSP est l’interférence potentielle due à la protéine MSP elle-même. La concentration de la protéine cible ne peut pas être facilement déterminée par mesure de l’absorbance à 280 nm, et la MSP peut générer un signal de fond lorsqu’elle est utilisée avec la protéine cible dans certains tests.
De plus, des détergents sont utilisés avec les Nanodiscs MSP pour solubiliser la membrane cellulaire. Il est donc essentiel de choisir un détergent qui n’altère pas le repliement de la protéine cible. Les Nanodiscs synthétiques ne nécessitent au contraire aucun détergent, car les polymères utilisés assurent à la fois la solubilisation et la stabilisation. La section suivante présente des exemples d’utilisation des Nanodiscs dans différentes applications.
Applications
Les Nanodiscs sont adaptés aux applications nécessitant des protéines membranaires dans leur état natif au sein d’un système de membrane modèle. Le tableau suivant présente des exemples de publications dans lesquelles des Nanodiscs ont été utilisés pour étudier différentes protéines dans diverses applications.
| Application | Protéine étudiée | Origine | Référence |
|---|---|---|---|
| Liaison d’agonistes/antagonistes et échange de radiomarquage dans les protéines G | récepteur β2-adrénergique | humain | (6) |
| Résonance plasmonique de surface (SPR) | mutant CD4 | humain | (7) |
| Spectroscopie Raman de résonance | cytochrome P450 | mammifère | (8) |
| Spectroscopie de fluorescence résolue en temps | complexe collecteur de lumière II (LHCII) | épinard | (9) |
| Spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI-MS) | divers | divers | (10,11) |
| Spectrométrie de masse non covalente (LILBID-ESI-MS) | KcsA, LspA, EmrE, Hv1, protéorhodopsine, MraY | humain, bactéries | (12) |
| Microscopie électronique (EM) | complexe collecteur de lumière II (LHCII) | épinard | (13) |
| Cryo-microscopie électronique (EM) | complexe cySecYEG, complexe de toxine TcdA1 | bactéries | (14, 15) |
| Vaccination de souris | hémagglutinine (HA) | virus influenza | (16) |
| Résonance magnétique nucléaire (RMN) | OmpX, mutant CD4 | humain, bactéries | (17, 18) |
| Analyse RMN de protéines solubles interagissant avec les lipides | protéines de liaison aux phosphoinositides | humain | (19) |
| Transfert dans des bicelles pour RMN | signal peptidase II de lipoprotéine (LspA) | humain | (20) |
| Études de phosphorylation / activation des protéines | récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) | humain | (21) |
Goal-oriented, time line driven scientist, proficiently trained in different academic institutions in Germany, France and the USA. Experienced in the life sciences e-commerce environment with a focus on product development and customer relation management.
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