You are viewing an incomplete version of our website. Please click to reload the website as full version.
Immunotransfert et test de Western blot

Test de Western blot (immunotransfert) : Électrophorèse de protéines sur gel

Le Western Blot (aussi appelé immunotransfert) est une technique employée pour analyser des protéines individuelles dans un mélange protéique (par ex., un lysat de cellules). Dans le cadre du Western blot (immunotransfert), le mélange protéique est soumis à une électrophorèse sur gel dans une matrice porteuse (SDS-PAGE, PAGE native, focalisation isoélectrique, électrophorèse sur gel bidimensionnelle, etc.) afin de trier les protéines par taille, charge, ou toute autre différence au sein des bandes individuelles de protéines. Les bandes de protéines séparées sont ensuite transférées vers une membrane porteuse (par ex., nitrocellulose, nylon ou PVDF). Ce procédé porte le nom de transfert. Les protéines adhèrent à la membrane de la même manière qu'elles ont été séparées en raison des interactions entre les charges. Les protéines de cet immunotransfert peuvent ensuite être utilisées pour être liées à l'anticorps en vue de la détermination.



On utilise des anticorps pour détecter des protéines cibles sur le Western blot (immunotransfert). Les anticorps sont conjugués à des marqueurs fluorescents ou radioactifs ou encore à des enzymes pour provoquer une réaction suite à l'ajout d'un réactif, entraînant une coloration ou une émission de lumière qui favorise la détection.

Le terme s'appuie sur un jeu de mots. Le transfert de Southern, qui est une méthode de détection de séquences ADN spécifiques, tire son nom de Ed Southern, qui a été le premier à décrire cette procédure. Le Western blot (immunotransfert), de même que le transfert de Northern (pour la détection d'ARN), joue sur la signification de ce nom.




Quel type d'électrophorèse de protéines sur gel peut-on réaliser ?

Test de Western blot (immunotransfert)

Différents types d'électrophorèse de protéines sur gel peuvent être employés, en fonction des critères de séparation des protéines. Les méthodes d'électrophorèse communément utilisées sont : , native-PAGE et la focalisation isoélectrique.

SDS-PAGE :
Il s'agit d'une méthode de dénaturation en ce qu'elle menace les protéines avec un détergent SDS (dodécylsufate de sodium) anionique. Les structures secondaire et tertiaires sont alors détruites. De plus, le SDS se lie aux protéines et couvre leurs charges chimiques, entraînant l'obtention de protéines à charge négative égales. Par conséquent, la séparation suivante intervient uniquement en fonction de la taille des chaînes polypeptidiques dans le gel de polyacrylamide.

PAGE native :
Des protéines natives, dépliées et non dénaturées peuvent être séparées grâce à cette méthode. Cette dernière permet de séparer les protéines qui ne peuvent être atteintes par d'autres méthodes. La séparation des protéines modifiées et non modifiées de même type (par ex., protéine phosphorylée/non phosphorylée) en est un exemple. La PAGE native peut également être utilisée pour confirmer des conformations pertinentes sur le plan biologique, telles que les formes di-, tri- ou tétramériques des protéines (contrairement à la SDS-PAGE, qui séparerait les chaînes peptidiques individuelles et dénaturées). Cette méthode peut aussi permettre de détecter divers complexes de protéines différentes.

La séparation au moyen de la méthode PAGE native dépend d'un certain nombre de paramètres comme la charge, la taille et la structure tridimensionnelle de la protéine. Un tampon adapté est requis pour préserver le repli tridimensionnel de la protéine. L'applicabilité du tampon dépend du point isoélectrique et des charges de la protéine.

Focalisation isoélectrique :
Cette méthode s'appuie sur le fait qu'une protéine possède une certaine charge à des valeurs de pH données. Selon le pH, les groupes fonctionnels basiques ou acides contribuent à augmenter ou à diminuer la charge totale de la protéine. Le point isoélectrique est défini comme le point auquel la charge de la molécule est nulle du fait que la quantité de charges positives et de charges négatives dans la molécule est identique.

Des gels en gradient spéciaux sont nécessaires pour la focalisation isoélectrique du fait que le pH varie d'acide à basique d'un gradient à un autre dans le gel. En raison de la charge électrique associée au gel, la protéine se déplace jusqu'au point dans le gel où la charge du gel est identique à celle de la protéine et où la charge totale est nulle : c'est ce que l'on appelle le point isoélectrique. Cette méthode est donc utilisée pour séparer les protéines en fonction de leur charge, ainsi que pour déterminer le point isoélectrique d'une protéine cible. La séparation intervient en fonction de la charge de la protéine ou du nombre de groupes acides et basiques contenus dans la protéine.

Les méthodes d'électrophorèse de protéines sur gel décrites plus haut peuvent également être combinées pour séparer les protéines. Le choix de la méthode dépend des exigences spécifiques de l'expérience.

Haut de page


Transfert

Une fois le mélange de protéines séparé, les bandes de polypeptides sont transférées vers une membrane porteuse. Pour ce faire, la membrane est fixée au gel et ce « sandwich » est transféré vers une chambre d'électrophorèse. Il est possible qu'une partie du SDS soit lavée, et que la protéine soit en partie renaturée, c'est-à-dire qu'elle regagne sa structure bidimensionnelle et tridimensionnelle. Cependant, la charge électrique appliquée entraîne la migration verticale des protéines en dehors du gel, dans le même sens que celui emprunté lors de leur migration dans le gel, pour finir sur la membrane. Les bandes de protéines sont alors liées à la membrane. Les bandes « transférées » peuvent désormais être utilisées à d'autres fins (par ex., pour la détection de protéines spécifiques avec des anticorps spécifiques).

Haut de page


Immunodétection

Il est possible d'identifier des anticorps spécifiques une fois les protéines séparées et transférées. Les anticorps (monoclonaux ou polyclonaux) spécifiques se lient à « leur » bande de protéines. Les anticorps sans liaison spécifique sont éliminés par lavage à l'aide de tampons contenant un détergent. De plus, des poches de liaisons non spécifiques peuvent se retrouvées bloquées avant que des anticorps spécifiques ne soient ajoutés.

Les anticorps primaires sont généralement appliqués en premier, avant d'être reconnus par un anticorps secondaire. L'anticorps secondaire est conjugué à de la couleur, de la radioactivité ou une enzyme aux fins de la détection. Des anticorps conjugués à de la biotine sont également utilisés à cette fin.

Il peut parfois être utile d'utiliser des anticorps primaires polyclonaux car ces anticorps reconnaissent divers épitopes, contrairement aux anticorps monoclonaux dont l'affinité de liaison est limitée. Suite à l'immunodétection, il est possible d'éliminer l'anticorps de la membrane pour une analyse approfondie avec d'autres anticorps (par ex., pour détecter d'autres anticorps spécifiques dans le mélange protéique soumis à analyse).

L'analyse du Western blot est ensuite réalisée à l'aide d'un éventail de systèmes d'imagerie différents (par ex., luminescence, réaction colorante, autoradiographique).

Haut de page


Pourquoi réaliser un Western blot (immunotransfert) ?

La méthode du Western blot (immunotransfert) offre toute une gamme d'avantages par comparaison à d'autres dosages d'immuno-absorption tels que le dosage .

Le Western blot (immunotransfert) dépasse le concept du test ELISA en permettant la séparation du mélange protéique par taille, charge et/ou conformation. La méthode d'élimination décrite permet de détecter plusieurs cibles, contrairement au test ELISA qui permet de ne détecter qu'une seule protéine. Étant donné que l'électrophorèse de protéines sur gel sépare les protéines en bandes, il est possible de déterminer la taille de la protéine/du polypeptide cible. Il est également possible de (semi-)quantifier la protéine d'intérêt en exécutant en parallèle une analyse interne de quantité sur les échantillons dans le gel. De la même manière, la teneur en protéines des échantillons peut être comparée (« échantillon A comporte plus de protéines que l'échantillon B »).

Un des inconvénients du Western blot (immunotransfert) réside dans le fait qu'il est coûteux en temps (par rapport au test ELISA) et exige de l'expérimentateur une solide expérience. En outre, il requiert une optimisation des conditions expérimentales (par ex., isolation des protéines, tampons, type de séparation, concentration de gel, etc.).

Il existe de nombreux types différents et de nombreuses méthodes différentes de Western blot (immunotransfert). C'est pourquoi il couvre de nombreux sujets et de nombreuses applications.

Conseil : Découvrez près de