Les anticorps secondaires
antibodies-onlineLes anticorps secondaires se lient aux anticorps primaires plutôt que directement à l'antigène cible. Ils sont largement utilisés pour la détection et l'amplification du signal dans des méthodes telles que le Western blot, l'immunohistochimie (IHC), l'immunofluorescence (IF), la cytométrie en flux, l'ELISA et les protocoles basés sur l'immunoprécipitation.
La sélection d'un anticorps secondaire approprié ne consiste pas uniquement à faire correspondre l'espèce de l'anticorps primaire. Les paramètres importants comprennent l'espèce hôte de l'anticorps primaire, la classe ou sous-classe d'immunoglobuline, la spécificité de liaison, le degré d'adsorption croisée, le format de l'anticorps ainsi que le marqueur de détection requis pour l'application.
Comment choisir un anticorps secondaire
Les paramètres suivants doivent être pris en compte lors du choix d'un anticorps secondaire :
- Identifier l'espèce hôte de l'anticorps primaire. Un anticorps primaire produit chez le lapin nécessite un anticorps secondaire anti-lapin, tandis qu'un anticorps primaire de souris nécessite un anticorps secondaire anti-souris.
- Déterminer la classe d'immunoglobuline et, le cas échéant, la sous-classe. Par exemple, un anticorps monoclonal IgG1 de souris peut être détecté à l'aide d'un anticorps secondaire anti-IgG de souris général ou d'un anticorps secondaire spécifique de la sous-classe IgG1.
- Sélectionner la spécificité d'anticorps requise. Selon l'expérience, il peut s'agir d'un anticorps secondaire IgG (H+L), spécifique de la chaîne lourde, spécifique de la région Fc, spécifique de la région Fab ou spécifique d'une sous-classe.
- Prendre en compte l'adsorption croisée. Les anticorps secondaires adsorbés de manière croisée peuvent réduire les liaisons indésirables aux immunoglobulines de l'espèce de l'échantillon ou à d'autres anticorps primaires utilisés dans des expériences multiplex.
- Choisir le format d'anticorps approprié. Les IgG entières conviennent à de nombreuses applications générales de détection, tandis que les fragments F(ab')2 ou Fab peuvent présenter des avantages dans les expériences impliquant des récepteurs Fc, la pénétration tissulaire ou des protocoles multiplex spécialisés.
- Sélectionner le conjugué en fonction de la méthode de détection. Les options courantes comprennent la HRP, la phosphatase alcaline, la biotine et des fluorochromes tels que le FITC, la PE, Alexa Fluor et DyLight.
- Vérifier que l'anticorps secondaire est validé ou adapté à l'application prévue. Les exigences varient entre le Western blot, l'ELISA, l'IHC, l'IF, la cytométrie en flux et d'autres techniques.
Terminologie importante : L'espèce cible ou la réactivité d'un anticorps secondaire correspond à l'espèce dans laquelle l'anticorps primaire a été produit. L'espèce hôte de l'anticorps secondaire correspond à l'animal dans lequel l'anticorps secondaire lui-même a été produit.
Classe, sous-classe et spécificité de liaison des anticorps
Les classes d'immunoglobulines sont définies par leurs chaînes lourdes. Chez les mammifères, les principales classes d'immunoglobulines sont les IgG, IgM, IgA, IgE et IgD. Leurs chaînes lourdes sont respectivement désignées gamma, mu, alpha, epsilon et delta. Les immunoglobulines contiennent en outre des chaînes légères kappa ou lambda.
La spécificité d'un anticorps secondaire détermine la région de l'anticorps primaire qu'il reconnaît. La sélection d'une spécificité appropriée peut réduire le bruit de fond et revêt une importance particulière dans les expériences multiplex.
- IgG (H+L) : reconnaissent des épitopes présents à la fois sur les chaînes lourdes et légères. Ces anticorps assurent une reconnaissance étendue et sont couramment utilisés pour l'immunodétection générale. Comme les chaînes légères sont communes à différentes classes d'immunoglobulines, les anticorps H+L peuvent également reconnaître d'autres classes d'immunoglobulines de la même espèce.
- Spécifique de la chaîne lourde : reconnaît la chaîne lourde d'une classe d'immunoglobuline définie, telle que les IgG, IgM ou IgA. Cette spécificité est utile lorsqu'une discrimination entre différentes classes d'immunoglobulines est nécessaire.
- Spécifique de la région Fc : reconnaît des épitopes situés dans la région Fc de l'anticorps primaire et évite la liaison aux fragments Fab.
- Spécifique de la région Fab : reconnaît la partie de l'anticorps primaire impliquée dans la liaison à l'antigène et peut être utile lorsque les interactions spécifiques de la région Fc doivent être évitées.
- Spécifique d'une sous-classe : distingue des sous-classes d'immunoglobulines telles que les IgG1, IgG2a, IgG2b ou IgG3 de souris. Les anticorps secondaires spécifiques d'une sous-classe sont particulièrement utiles lorsque plusieurs anticorps primaires monoclonaux provenant de la même espèce sont utilisés dans une même expérience.
Anticorps secondaires adsorbés de manière croisée
Les immunoglobulines provenant de différentes espèces présentent des épitopes structurellement apparentés. Par conséquent, un anticorps secondaire dirigé contre les immunoglobulines d'une espèce peut également reconnaître les immunoglobulines d'une autre espèce. Cette réactivité croisée peut entraîner une coloration de fond ou une détection involontaire d'autres anticorps présents dans l'expérience.
Les anticorps secondaires adsorbés de manière croisée sont purifiés de façon supplémentaire contre les immunoglobulines ou protéines sériques d'espèces potentiellement sujettes à une réactivité croisée. Cela permet de réduire les réactions croisées indésirables entre espèces et est particulièrement utile pour :
- l'immunofluorescence ou l'immunohistochimie multiplex,
- les échantillons contenant des immunoglobulines endogènes,
- les tissus ou populations cellulaires riches en anticorps,
- les expériences combinant des anticorps primaires provenant de plusieurs espèces et
- les immunoessais sandwich indirects dans lesquels plusieurs espèces d'anticorps sont présentes.
Pour la coloration tissulaire, l'anticorps secondaire doit idéalement avoir été adsorbé de manière croisée contre l'espèce dont proviennent le tissu ou les cellules. Dans les expériences multiplex, chaque anticorps secondaire doit également présenter une réactivité croisée minimale avec les espèces des autres anticorps primaires.
Cependant, une adsorption croisée extensive contre des espèces étroitement apparentées telles que la souris et le rat peut réduire la reconnaissance de certains épitopes. Le degré d'adsorption croisée requis doit donc être adapté au système expérimental.
Formats des anticorps secondaires : IgG entières, F(ab')2 et Fab
Les anticorps secondaires sont disponibles sous forme d'immunoglobulines entières ou de fragments d'anticorps. Le format approprié dépend de l'échantillon et de l'application.
| Format | Propriétés | Considérations typiques |
|---|---|---|
| IgG entière | Anticorps bivalent contenant des régions Fab et Fc. | Convient à la plupart des applications standard de Western blot, ELISA, IF et IHC et fournit généralement un signal intense. |
| F(ab')2 | Fragment bivalent dépourvu de région Fc, généré par clivage protéolytique sous la région charnière. | Utile pour les cellules ou tissus contenant des récepteurs Fc et peut améliorer l'accessibilité dans certains échantillons grâce à sa taille réduite. |
| Fab | Fragment monovalent de liaison à l'antigène dépourvu de région Fc. | Utile pour les stratégies de blocage, pour réduire la réticulation induite par les anticorps et pour des protocoles spécialisés de marquage multiple. |
Espèces hôtes des anticorps secondaires
La souris et le lapin figurent parmi les espèces hôtes les plus fréquemment utilisées pour la production d'anticorps primaires. Par conséquent, les anticorps secondaires anti-souris et anti-lapin sont largement utilisés. Les anticorps secondaires eux-mêmes peuvent être produits dans différentes espèces hôtes, notamment la chèvre, l'âne, le lapin et d'autres espèces.
L'espèce hôte de l'anticorps secondaire devient particulièrement importante dans les expériences multiplex. Lorsque cela est possible, des anticorps secondaires dirigés contre différentes espèces d'anticorps primaires peuvent être choisis avec une même espèce hôte. Cela réduit le risque que différents anticorps secondaires se reconnaissent mutuellement.
Si des anticorps secondaires provenant de différentes espèces hôtes doivent être combinés, une adsorption croisée appropriée contre les autres espèces utilisées dans l'expérience doit être envisagée.
Marqueurs de détection et conjugués
Les anticorps secondaires sont disponibles sous forme non conjuguée ou conjugués à des enzymes, des fluorophores, de la biotine et d'autres marqueurs de détection. Le conjugué optimal dépend de la méthode expérimentale, de l'instrument de détection, de la sensibilité requise et de l'utilisation d'une détection simple ou multiplex.
- Peroxydase de raifort (HRP) : largement utilisée pour la détection chimioluminescente et colorimétrique en Western blot et ELISA. Une grande variété de substrats est disponible.
- Phosphatase alcaline (AP) : offre une alternative de détection enzymatique pour les essais colorimétriques ou chimioluminescents. La sensibilité relative de la HRP et de l'AP dépend du substrat, du format de l'essai et du système de détection plutôt que de l'enzyme seule.
- Biotine : les anticorps secondaires biotinylés peuvent être détectés à l'aide de systèmes basés sur l'avidine ou la streptavidine et permettre une amplification supplémentaire du signal. La présence de biotine endogène doit être prise en compte lors du travail avec certains tissus.
- Fluorophores : les conjugués fluorescents permettent une détection optique directe et sont particulièrement utiles pour l'immunofluorescence, la cytométrie en flux et le Western blot fluorescent.
- Phycoérythrine (PE) et autres protéines fluorescentes : sont fréquemment utilisées en cytométrie en flux, où une forte intensité de fluorescence est avantageuse.
Pour les expériences de fluorescence multiplex, les fluorophores doivent être sélectionnés en fonction des sources d'excitation et des canaux de détection de l'instrument, tout en minimisant le chevauchement spectral entre les marqueurs.
En savoir plus sur les marqueurs et conjugués de protéines ou comparer les fluorophores couramment utilisés dans notre guide des maxima d'excitation et d'émission.
Anticorps secondaires pour les expériences multiplex
L'immunofluorescence multiplex et l'immunohistochimie multiplex nécessitent une attention particulière concernant la spécificité et la réactivité croisée des anticorps.
Dans la mesure du possible, des anticorps primaires provenant de différentes espèces hôtes doivent être sélectionnés. Chaque anticorps secondaire peut alors reconnaître spécifiquement une espèce d'anticorps primaire. Les anticorps secondaires doivent être adsorbés de manière croisée contre les espèces des autres anticorps primaires et, le cas échéant, contre l'espèce de l'échantillon.
Si plusieurs anticorps primaires monoclonaux provenant de la même espèce sont nécessaires, différentes sous-classes d'immunoglobulines peuvent parfois être distinguées à l'aide d'anticorps secondaires spécifiques de sous-classe. Les stratégies de coloration séquentielle, le blocage à l'aide de fragments Fab ou les anticorps primaires directement conjugués constituent d'autres possibilités pour les expériences multiplex utilisant plusieurs anticorps d'une même espèce.
Les marqueurs fluorescents doivent également présenter une séparation spectrale suffisante afin de permettre une distinction fiable des différents signaux.
Choisir les anticorps secondaires selon l'application
| Application | Stratégie de détection courante | Critères de sélection importants |
|---|---|---|
| Western Blot | Conjugués HRP, AP ou fluorescents | Faire correspondre l'espèce et la classe de l'anticorps primaire. Les Western blots multiplex fluorescents nécessitent des marqueurs spectralement distincts et des profils de réactivité croisée appropriés. |
| ELISA | Détection basée sur la HRP, l'AP ou la biotine | Prendre en compte la spécificité de classe et les interactions possibles avec les autres anticorps utilisés dans l'essai. |
| Immunofluorescence (IF) | Anticorps secondaires conjugués à des fluorophores | L'adsorption croisée contre l'espèce de l'échantillon et les espèces des autres anticorps primaires est particulièrement importante dans les expériences multiplex. |
| Immunohistochimie (IHC) | Anticorps conjugués à une enzyme ou à un fluorophore | Prendre en compte les immunoglobulines endogènes, les récepteurs Fc, l'espèce de l'échantillon et la compatibilité avec les approches multiplex. |
| Cytométrie en flux | Anticorps secondaires fluorescents | Choisir des fluorophores adaptés au cytomètre. Le blocage des récepteurs Fc et/ou les anticorps secondaires F(ab')2 peuvent être utiles pour les populations cellulaires riches en récepteurs Fc. |
| Immunoprécipitation / IP-Western | Détection secondaire spécifique de l'application | Les anticorps secondaires conventionnels peuvent détecter les chaînes lourdes et légères de l'anticorps utilisé pour l'immunoprécipitation et produire des bandes correspondant aux masses moléculaires attendues des chaînes d'IgG. |
Cas particulier : IP-Western Blot
Dans les protocoles IP-Western, les anticorps secondaires conventionnels peuvent reconnaître les chaînes lourdes et légères dénaturées de l'anticorps utilisé pour l'immunoprécipitation. Ces signaux peuvent interférer avec la détection de protéines migrant à environ 50 kDa ou 25 kDa.
Les systèmes spécialisés de détection secondaire tels que TrueBlot® sont conçus pour réduire la détection des anticorps d'immunoprécipitation dénaturés.
Trouver le bon anticorps secondaire
Le premier critère de sélection est généralement l'espèce dans laquelle l'anticorps primaire a été produit. Parcourez ci-dessous les anticorps secondaires selon l'espèce hôte de l'anticorps primaire.
Anticorps secondaires par espèce hôte de l'anticorps primaire
Lors de l'utilisation d'anticorps primaires provenant de hamsters, il convient de déterminer, si possible, si l'anticorps provient d'un hamster arménien ou syrien, car la reconnaissance par les anticorps secondaires peut ne pas être complète entre les différentes espèces de hamsters.
Anticorps secondaires par conjugué
Anticorps secondaires par application
Isotypes d'immunoglobulines
En savoir plus sur les classes d'immunoglobulines et les anticorps secondaires conçus pour reconnaître des isotypes spécifiques :
- » Anticorps secondaires contre l'immunoglobuline G (IgG)
- » Anticorps secondaires contre l'immunoglobuline A (IgA)
- » Anticorps secondaires contre l'immunoglobuline E (IgE)
- » Anticorps secondaires contre l'immunoglobuline D (IgD)
- » Anticorps secondaires contre l'immunoglobuline M (IgM)
- » Anticorps secondaires contre l'immunoglobuline Y (IgY)
