Qu'est-ce que la cytométrie de flux (analyse FACS) ?

La cytométrie de flux (analyse FACS) est une méthode qui permet d'évaluer les protéines de la membrane cellulaire, les protéines intracellulaires ainsi que les peptides et l'ADN. Le principe sous-jacent de l'analyse FACS est une réaction antigène-anticorps, les anticorps étant marqués par fluorescence. La quantification de la cytométrie de flux est réalisée en intercalant des marqueurs de couleur (sans l'anticorps).


Qu'est-ce que l'analyse FACS ?

L'acronyme FACS" (ou analyse FACS) signifie fluorescence activated cell sorting en anglais (tri cellulaire induit par fluorescence). Le terme FACS est à l'origine un nom de marque de Becton Dickinson (BD) qui a gagné en popularité et est aujourd'hui le nom commun employé pour désigner la cytométrie de flux. Cependant, l'équipement et les machines nécessaires à la cytométrie de flux continuent d'être proposés par plusieurs fabricants sous des noms différents.

La base d'une analyse FACS repose sur une suspension (colorée et) marquée de cellules individuelles soumise à un faisceau laser focalisé. Des forces capillaires poussent les cellules à franchir la cellule de flux, où les marqueurs sont stimulés par le rayonnement du laser. La lumière fluorescente émise par les fluorophores (combinés aux anticorps) et la lumière diffusée sont détectées séparément.


Diffusion lumineuse

Les cellules diffusent une fraction lumineuse qui est ensuite détectée par des photomultiplicateurs (détecteurs de lumière). La quantité de lumière mesurée correspond à la taille des cellules et à leur complexité. Les , par exemple, reflètent davantage de lumière que les lymphocytes B ou T à surface lisse en raison de la texture rugueuse de leur surface et de la quantité plus élevée de vésicules présentes dans la cellule. L'analyse de la diffraction de la lumière selon un angle plat est appelée prodiffusion (FSC, forward scatter), laquelle dépend du volume de la cellule. L'analyse de la diffraction de la lumière dans un angle droit est appelée diffusion latérale (SSC, sidewards scatter). Elle dépend de la granularité, de la taille des cellules, de la structure de leur noyau, et de la quantité de vésicules contenues dans les cellules. Par exemple, il est possible de distinguer des globules rien qu'en observant ces deux analyses (Fig. 1).

Caractérisation de cellules non colorées à l'aide d'une diffusion de lumière (graphique à points)

Fig. 1. Caractérisation de cellules non colorées à l'aide d'une diffusion de lumière (graphique à points) En haut à droite : grosses cellules En haut : cellules granulaires Les grosses cellulaires granulaires (par ex., les ) sont visibles en haut à droite tandis que les petits globules blancs, qui sont lisses, sont visibles en bas à gauche.


Analyses de la fluorescence (analyse par cytométrie de flux)

Des couleurs fluorescentes peuvent être mesurées de manière simultanée à l'aide de la lumière diffusée lors de la cytométrie de flux. Seules quelques cellules produisent une lumière fluorescente de manière endogène. En utilisant, par exemple, les substances colorimétriques DAPI et iodure de propidium qui s'intercalent dans l'ADN d'une cellule (entre les paires de base), il est possible de mesurer la quantité d'ADN d'une cellule en déterminant la brillance de cette cellule. Des anticorps marqués par fluorescence peuvent également être utilisés. En général, les anticorps utilisés ciblent les protéines de surface (par ex., les  ; CD = cluster de différenciation). La densité d'informations peut être augmentée en utilisant des filtres et une lumière laser de couleurs différentes. Si les longueurs d'ondes de la lumière transmise par fluorescence depuis les fluorophores peut être discernée, alors il est possible d'utiliser plusieurs marqueurs de couleurs (coloration multiple).

Schéma des cellules colorées dans une analyse FACS

Fig. 2. Schéma des cellules colorées dans une analyse FACS. La première image représente une cellule positive et une cellule négative. Le fluorochrome combiné à l'anticorps est stimulé par la lumière du laser et émet une lumière fluorescente d'une certaine longueur d'onde (en rouge). La lumière est mesurée au niveau du canal fluorescent 1. La deuxième image illustre une cellule CD80 négative et une cellule CD14 positive. Le canal deux analyse la lumière du fluorochrome d'une autre longueur d'onde (en vert).

Grâce au logiciel du fabricant de l'équipement, les résultats finaux des analyses réalisées sont présentées dans un graphique. Le type de graphique peut être choisi par l'utilisateur. Généralement, les graphiques à point et les histogrammes sont les plus utilisés. Les colorations mentionnées plus haut pourraient donner ceci :


GRAPHIQUE À POINTS

Schéma des cellules colorées dans une analyse FACS

Fig. 3. Illustration d'un graphique à points pour les cellules CD14 et CD80. Les cellules négatives aux deux marqueurs figurent en bas à gauche, les cellules positives au en bas à droite et les cellules positives au en haut à gauche. Les cellules positives aux deux marqueurs figurent en haut à droite. L'intensité de la fluorescence augmente de gauche à droite (axe des X) et de bas en haut (axe des Y).


Histogramme

Ces deux histogrammes représentent les résultats des marqueurs de surface CD14 (a) et CD80 (b) pris séparément.

Ces deux histogrammes représentent les résultats des marqueurs de surface CD14 (a) et CD80 (b) pris séparément.

Fig. 4. Ces deux histogrammes représentent les résultats des marqueurs de surface (a) et (b) pris séparément. L'axe des X représente l'intensité de la fluorescence ; l'axe des Y représente le nombre de cellules. La barre représente la quantité de cellules positives.

Conseil : le site anticorps-enligne.fr propose plus de 54,000 antibodies" pour la cytométrie en flux (analyse FACS).